使用方法:
1. 常用篩選濃度
注意:用來篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞類型,培養基,生長條件和細胞代謝率而變化,推薦使用濃度為50-1000μg/mL。對于第一次使用的實驗體系建議通過建立殺滅曲線(kill curve),即劑量反應性曲線,來確定最佳篩選濃度。
一般而言,哺乳動物細胞50-500μg/mL;細菌/植物細胞20-200μg/mL;真菌300-1000μg/mL。
2. 殺滅曲線的建立
注意:為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株,需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素濃度,可通過建立殺滅曲線(劑量反應曲線)來實現,至少選擇5個濃度。
1) 第一天:未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上,37℃,CO2培養過夜;注:對于需要更高密度來檢測活力的細胞,可增加接種量。
2) 根據細胞類型,設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例,可設定50,100,250,500,750,1000μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/ml,然后按照下表稀釋到相應濃度的工作液。
3) 第二天:替換舊的培養基,換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個濃度做三個平行孔。
4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養基。
5) 按照固定的周期(如每2天)進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(通常是7-10天)內能夠殺死絕大多數細胞的濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。
3. 穩定轉染細胞的篩選
1) 轉染48h后,用含有適當濃度的潮霉素B篩選培養基來傳代細胞(直接傳代或者稀釋后傳代)。
注意:細胞處于活躍分裂狀態時抗生素的殺傷。則當細胞過于稠密,其效率會降低。為了得到較好的篩選效果,最好將細胞稀釋至豐度不超過25%
2) 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養液。
3) 篩選7天后觀察并評估細胞克隆(集落)的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間,這取決于宿主細胞類型,轉染,以及篩選效果。
4) 挑取并轉移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養板,繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。
5) 之后更換正常培養基培養即可。
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貨號:BJ-01R3378
規格:10ml
分類:培養基
儲存條件:4℃,12個月
用途:主要用于植物的溶液培養,檢測植物生長速率。
注意事項:主要由、edta等組成。
注意事項:
1、盡注意無菌操作,避免污染。
2、避免反復凍融。
3、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
標準溶液的配制:
1.直接配制法 對于純凈的物質(稱做基準物質)可準確進行稱量,用蒸餾水溶解后,轉移到一定容積的容量瓶中稀釋至標線,溶液的準確濃度可以直接計算出來。溶質的純度、性質等對濃度有較大影響,為此,對用來直接配制標準溶液用的基準物質必須具備以下條件:
(1)物質的純度要高,含量不得低于99.9%,雜質的含量應當少到可以忽略的程度。
(2)物質的分子組成應與其化學式*符合,包括結水合物中的結品水含量也必須與其化學式相符合。如硼砂Na2B4O7·10H2O等。
(3)性質穩定,貯蔵時應不發生變化,不易吸收空氣中的水分、二氧化碳等氣體而改變其成分,不易風化潮解和被空氣氧化,烘干時不易分解等。此外最好使用分子量較大的基準物質以減小稱量誤差。
2.間接配制法 凡不符合基準物質條件的物質,可先配制成近似所需濃度的溶液,再用基準物質溶液或能與其發生定量反應的標準溶液進行滴定,求其準確濃度,這種通過滴定來確定準確濃度的操作叫做“標定”。間接法配制近似濃度溶液時不需用分析天平稱量和容量瓶配制,可用臺秤、量筒等器皿。將稱好的物質轉移到干凈的試劑瓶中,先加少量蒸餾水將其溶解,繼續用量筒加蒸餾水至需要量即可。由于大多數試劑不符合基準物的條件,故間接法配制標準溶液是經常的。如固體NaOH因易吸收空氣中的水分而潮解和吸收CO2使表面變質;濃鹽酸因易揮發而無法準確稱量;不易得到分析純級的試劑等,這些物質的標準溶液須用間接法來配制,經標定后再做標準溶液使用。
標準溶液的標定:
1.用基準物質標定法
(1)多次稱量法 用減重法精密稱取幾份(如2~3份)基準物質,分別倒入編號的干凈錐形瓶(或燒杯)內,各加少量蒸餾水溶解,再加指示劑后分別用待標定溶液滴定至等當點,各自記錄所消耗待標定溶液的體積,結合基準物質的重量分別算出溶液的準確濃度,最后取平均值做為標準溶液的濃度。
(2)移液管法 精密稱取一份基準物質,在干凈的小燒杯內加少量蒸餾水溶解,順玻棒全部轉移到已校正好的容量瓶中,多次沖洗燒杯洗液并入容量瓶中,最后配成一定體積的溶液,混勻。每次滴定用配套的移液管吸取并轉移至錐形瓶中,加指示劑后用待標定溶液滴定至等當點,每次做好記錄,根據所消耗待標定溶液的體積,結合基準物質的重量,分別算出溶液的準確濃度取平均值做為標準溶液的濃度。
2.比較法標定 如果待標定溶液能與某標準溶液進行反應,可吸量一定體積的某標準溶液,用待標定溶液滴定,或吸量一定體積的待標定溶液,用某標準溶液滴定。根據兩溶液所消耗的毫升數及某標準溶液的濃度,按N1V1=N2V2式可以計算出待標定溶液的準確濃度。這種用標準落液來測定待標定溶液準確濃度的過程稱為“比較法”標定。如果某標準溶液的濃度由于某些原因不夠準確時,就會直接影響待標定溶液濃度的準確性,顯然比較法不如用基準物質直接標定的方法精確,但比較法簡便易行。
標定完畢,蓋緊標準溶液試劑瓶塞,瓶簽上注明標準溶液名稱、準確濃度和日期等。
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Dermatobia hominis人膚蠅探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周EEF2 真核翻譯延因子2抗體 規格: 0.2ml
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White Sturgeon Iridovirus(WSIV)高首鱘虹彩病毒LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周CXorf56 X染色體開放閱讀框56抗體 規格: 0.2ml
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