組成及試劑配制:
1、酶標板:一塊(96孔)
2、 標準品(凍干品): 2瓶,請臨用15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為200 U/L,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液:1×20ml。
4、 檢測稀釋液A:1×10ml。
5、 檢測稀釋液B:1×10ml。
單增李斯特菌核酸檢測試劑盒優點:①靈敏度高、特異性強。
②時間短,2-3小時出結果。
③檢測結果可定量。
④操作簡便。
缺點:①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結果會出現假陽性。(可用培養法做補充驗證)
②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大(由于引物及內在設計不同),需謹慎選擇,盡量在業人員推薦指導下使用。
【質量控制】
1.陰性對照:Ct 值>38 或未檢出。
2.陽性對照:擴增曲線呈 S 型,且 Ct 值≤30。
3.同一實驗以上要求需同時滿足,否則本次實驗視為無效。
4.每種檢測靶標都需設陰陽對照,不同的靶標根據對應陰性調整基線閾值。
【結果判讀】
1.FAM 通道檢測 B 組鏈球菌。
2.陰性:Ct 值>38 或未檢出。
3.陽性:擴增曲線呈 S 型,且 Ct 值≤35。
4.可疑:擴增曲線呈 S 型,且 35<Ct 值≤38,需復檢;復檢結果若一致,判定結果為陽性。
【檢驗方法的局限性】
1.樣品采集、運輸、保存不當,試劑運輸、保存、配置不當都可能會影響實驗結果,甚至會導致假陰性結果。
2.如果實驗室污染、試劑污染、樣品交叉污染,可能出現假陽性結果。
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