革蘭氏染色的基本原理及操作方法！
革蘭氏染色的基本原理及操作方法！
革蘭染色法是1884年由丹麥醫師Gram創立，直到現今，革蘭氏染色法仍是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。
細菌先經堿性染料結晶紫染色，而后經碘液進行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細菌媒染后的顏色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌(G+),后者為革蘭氏陰性菌(G-)。為方便進一步觀察，脫色后可再用一種紅色染料如堿性番紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被重新染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌、螺旋體和大多數致病性的無芽孢桿菌都呈現負反應。
革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質上有很多差別，染色反應不一樣。現在一般認為革蘭氏陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結晶紫的復合物結合很牢，不易脫色，陰性菌復合物結合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應的主要依據。
另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同pH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的染色液pH和染色時間等條件要嚴格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應； pH很低時，則都可呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結晶紫-碘復合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間、脫色方法也應嚴格控制。
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：
(一)涂片固定
在干凈的載玻片*滴加一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液并涂布成直徑約1cm的薄層。為避免因菌數過多聚集成團，不利于觀察細菌個體形態，可在載玻片一側進行上述操作，而在另一側再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層。若材料為液體培養物或固體培養物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可，如菌液濃度較大，也可使用水滴再進行一次稀釋。
涂片在室溫條件下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈火焰上方較高的位置微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。
標本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：
(1)殺死微生物，固定細胞結構。
(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標本水洗時被水沖洗掉。
(3)改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易于染色。
固定常常利用高溫，手執載玻片的一端(涂有標本的遠端),標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次，共約2s-3s,并不時以載玻片背面加熱，載玻片背面觸皮膚，以不覺過燙為宜(不超過60℃),待放置冷后，再進行染色。
（二)染色
在固定過的涂片菌膜上滴加草酸銨結晶紫染液，染色液應*覆蓋整個菌膜，染色1min。
(三)水洗
染色到一定的時間，拿住玻片使之成450角，用細小的水流把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
(四)媒染
加碘液覆蓋涂面染1 min。在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。
(五)水洗，用吸水紙吸去水分
用細小的水流緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。
(六)脫色
加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色， 20 s~30 s后再進行水洗，吸去水分。
(七)復染
蕃紅染色液染色10 s后， 自來水沖洗。
(八)干燥，鏡檢
染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。
(1)水流沖洗時，將載玻片微微傾斜，讓水流從涂菌處的上方而不要直接在涂菌處沖洗，同時應調小水流避免染色液飛濺。染色液如果滴在水池或桌面上，可以用84消毒液擦拭去掉顏色，但要注意84消毒液不可直接用于皮膚和衣物等。
(2)在實驗中經常會出現假陽性和假陰性的結果，假陽性主要是由于脫色不*，可能是由于涂片過厚或者是結晶紫染色過度等，導致脫色不*。假陰性可能是因為細胞固定過度，造成細胞壁通透性的改變，而出現假陰性結果；另外，細胞培養時間過長，可能已經有部分細胞發生死亡或自溶，也導致細胞壁通透性的改變而出現假陰性的結果。避免假陽性或假陰性的辦法是在同一張載玻片上設置革蘭氏陽性菌(如*) 和革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)的對照與待染色的菌一起進行染色， 當對照菌呈現預期的染色結果時表明染色過程正常。
(3)所觀察的細胞一般應用18 h~24 h的活力培養物。因為一此菌株隨菌齡的變化在革氏染色反應和形態學上也會發生變化。
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