大鼠骨骼肌細胞 百歐博偉生物 細胞系

大鼠骨骼肌細胞 百歐博偉生物 細胞系

一、實驗材料

SD大鼠，細胞培養板，培養皿，小牛血清等。

二、實驗步驟之固定

⒈組織取材  

SD 大鼠吸入麻醉后腹腔內注射(22 mg/kg)。 以左側第 4 肋水平作橫切口, 取胸大肌約 1 cm3 , 并將其修剪成 1 mm3 大小的肌小粒 。反復用Hanks 液洗去血細胞 , 將肌小粒小心貼附于事先用明膠包被的細胞培養瓶底部 , 加入適量成肌細胞增殖培養液(Ham' s F-10 培養基中加入15 %小牛血清、*100 U/ml 、* 100 U/ml)。將瓶底向上輕置于37℃、5 %CO2 、飽和濕度的培養箱中, 4 h 后輕輕翻轉培養瓶 , 使肌小粒浸浴于培養液中。 3 d 換液一次 , 待細胞長滿瓶底即可傳代。

⒉成肌細胞的培養

采用組織塊培養法貼塊 2 d 后即可見有細胞從肌小粒邊緣爬出 , 細胞呈梭形, 胞漿透明。1 周后細胞可長滿瓶底的 60 %～ 70 %, 其數目可達 105 , 此時細胞可呈多角形 , 充分伸展, 部分細胞密集區可見細胞呈向心性生長 , 相互間排列整齊 , 類似骨骼肌的縱切面。

⒊成肌細胞的分化鑒定  

將傳代后的細胞接種至 6 孔板, 加入增殖培養液 , 待細胞長至80 %滿時, 換入成肌細胞誘導分化液(低糖DMEM培養基中加入 2 %馬血清、0 .5%雞胚提取物、青霉0100 U/ml 、* 100 U/ml), 換用誘導分化液后細胞可在 3 d 內分化 , 融合交織形成肌纖維, 可觀察到收縮現象;并且部分細胞分化形成細長的肌管, 高倍鏡下可見多個核及核分裂象。這些現象為成肌細胞所*, 可以作為簡便的鑒定方法。

⒋成肌細胞的免疫熒光鑒定    

免疫熒光在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min。水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（Desmin結蛋白）并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

三、注意事項

（1）原代培養材料的選擇，盡量選取完整的組織。

（2）要注意無菌操作。小心操作，避免污染細菌。其操作要求應高于*。

（3）整個取材操作要迅速，不能過長，以細胞活性。

（4）運用消化法時*溫度應低于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。

所以*不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。

（5）使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養液接觸，不要使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。

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