一、 產品基本介紹
1.1物理結構
USphereTM bubble contrast agent 系臨床前超聲成像造影劑（僅供科研用途），經靜脈注射后，可增強血液中的超聲信號，達到增強心血管疾病診斷或腫瘤檢測等目的。本超聲造影劑以八氟丙烷（Octafluoropropane， Perflutren，C3F8）氣體為核心氣體，外部以磷脂質（Phospholipids）材料作為殼層的單層膜微氣泡（Microbubble）。如Figure1所示，通過磷脂質的自組裝能力，磷脂層可以形成一個有效減緩氣體擴散（Diffusion）的保護膜，避免微氣泡相互融合成更大的氣泡，并且在體內穩定循環，增強造影時間。磷脂質殼層通常由2-3種磷脂質組成；表面經聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PET）修飾，避免了磷脂殼層之間相互團聚，其生物相容性亦有提升。
圖1微泡結構示意圖
1.2殼層成分
目前主流的超聲造影劑殼層材料均以磷脂質為主，其優勢在于磷脂質可以形成良好彈性的單層膜，保護微氣泡能夠在超聲波發射中產生穩定振動，進而表現出優異的聲學特性，增強超聲成像效果。
1.3氣體成分分析
目前市售的超聲造影劑產品多采用全氟碳化合物。相對于空氣，全氟碳化合物具有較大的分子量、極低的水溶解度和緩慢的擴散速率；因此全氟碳化合物穿透磷脂膜的理論能壘較高。全氟碳化合物可以有效減緩微泡泄氣速度，進而增強微泡的造影時間。USphereTM所使用的氣體成分亦為全氟碳化物。
二、 競爭產品比較與優勢分析
常見的商用動物超聲微泡造影劑有美系的OptisonTM（GE Healthcare）、Definity® （Lantheus Medical Imaging）、歐系的 SonoVueTM（Braco）和日系的SonazoidTM（GE Healthcare）。常見的商用造影劑比較表如表1。
優勢1．UsphereTM較其他產品具有非常優異的粒徑分布（如圖2），它的微泡共振頻率更適合用于目前醫療儀器的范圍，大幅度提高超聲信號的強度。其次，良好的粒徑分布可以控制穩定穴蝕（Stable Cavitation）及慣性穴蝕（Inertial Cavitation）所致的生物效應，進而降低其在檢測心血管疾病上的潛在風險和增強其在藥物遞送過程中的安全性。
優勢2．UsphereTM系列產品粒徑更小，在提供更為細致的成像品質的同時，仍保有在組織深部的回散射強度。
優勢3．UsphereTM單位體積內的微泡濃度可達2.5x1010Bubbles／mL，為同類產品中濃度較高者。由于其粒徑小、濃度高，對于腫瘤部位的血管造影更加明顯。
優勢4．UsphereTM具有良好的穩定與懸浮特性（如圖3），可以兼用作某些聲學研究（如超聲波場掃描與流體狀態分析）。
優勢5．UsphereTM體內循環時間高達6-15分鐘（如圖4），利于活體實驗。開封活化后三天可保持較高品質，方便活體實驗。而目前市*占有率較高的SonoVueTM僅有6小時的開封后使用時間。
圖2USphereTM的物理表征：
電子顯微鏡圖（Cryo-TEM）
粒徑分布圖（Multisizer3，USPcompliant)
表1常見商用超聲造影及對比表
Table1 Comparisons of Commercialized ultra-sound contrast agents
| 品名 | 制造商 | 殼層 成分 | 氣體 成分 | 平均粒徑 (ur) | 粒徑低于10 μm微泡比例 | 微泡濃度 (particles/mL) | 使用時間 (Min) |
| OptisonTM | GE Healthcare Medical Diagnostics | 白蛋白（注：目前市 場已淘汰該技術） | C3F8 | 3.0-4.5 | 95% | 5.0-8.0x108 | 1-5 |
| Definity® | Lantheus Medical Imaging | 脂類／表面活性劑 | C3F8 | 1.1-3.3 | 98% | 1.2x1010 | 3.4-7.1 |
| SonoVueTM | Bracco Diagnostics | 脂類／表面活性劑 | SF6 | 20-3.0 | 99%(<11μm) | 0.9-6x109 | 3-6 |
| SonazoidTM | GE Healthcare Medical Diagnostics | 脂類 | C4F10 | 2.1 | 99.5% | 1.2x109 | 6-15 |
| UsphereTM | Trust Bio-sonics/United Well | 脂類／磷脂質 | C3F8 | 1.1-1.4 | >99.9% | 2.0-3.0x1010 | 6-15 |
圖3USphereTM在水溶液中的懸浮性圖片
Figure 3 USphereTM in aqueous suspension
圖4 USphereTM與SonoVueTM的體內循環時間比較。SonoVueTM 180s；USphereTM540s．
Figure 4. Comparison of in vivo circulation time with SonoVueTM
三、 產品種類與應用
產品1．Prime
Prime是最基本的超聲造影劑類型，是針對小動物超聲成像設計的最*微氣泡造影劑。由于其擁有粒徑小、濃度高、穩定性佳的特性，且共振頻率覆蓋1-40MHz，適用于高解析度超聲設備（如Vevo2100，Braco系統等），以及大部分市售醫*超聲系統。Prime可以提供優異的對比影像，在基礎研究中適用范圍廣泛。
Prime 最基本的應用為檢測血液灌流（如圖5）、檢測微循環、輔助計算血流、心肌灌注等高靈敏度需求的診斷過程。使用微氣泡造影劑可提升深層組織的回散信號強度，進而有效延伸超聲波系統的成像深度。
圖5使用USphereTM小鼠腹部血液灌流檢測結果（Vevo2100小動物超聲成像儀）
Figure 5. Detection of blood perfusion of the mice abdomen 其他延伸應用包含：
(1) 心血管診斷
輔助觀察心室壁運動、心房或心室中膈缺損診斷、心肌缺血程度判斷與位置診斷、輔助冠心病診斷、氣球擴張術評估、及術后血管再阻塞追蹤。
(2) 腫瘤診斷
腫瘤血液灌流（圖6）與腫瘤轉移診斷、乳癌檢測。
Figure 6 Mice tumor blood perfusion with Prime in Vevo 2100
新藥開發、輔助肝硬化診斷、肝組織射頻燒灼術范圍偵測、超聲波系統演算法開發。由于微泡可與超聲波協同作用后可刺激細胞增加通透性、促進藥物釋放。微泡還可用于工業聲場量測量（acousticfield measurements）等。
產品2．Tracer
Tracer產品主要是在Prime上額外偶聯螢光物質（fluorescent agent），使微氣泡除了可以用作超聲造影劑以外，亦可以應用于熒光檢測。常見的用途包含：
(1) 藥物動力學研究
將熒光物質視為model drug，在熒光下觀察微氣泡的藥物動力學。圖7為在小鼠window chamber模型下觀測Tracer隨血液動力學與分布。
圖7在Window Chamber Model注射Tracer，觀察藥物動力學
Figure 7 Pharmacokinetic Analysis of Tracer in Mice Window Chamber Model
(2) 超聲波驅動藥物釋放監測
同樣將熒光物質視為model drug，配合超聲波的驅動，觀察超聲波釋放微氣泡內藥物的情形，亦可初步評估藥物治療情況。圖8為小鼠經超聲波驅動Tracer釋放螢光物質后，以IVIS（PerkinElmer）系統顯示：右側施打超聲波的小鼠腿部有熒光訊號累積的現象。
圖8以IVIS追蹤超聲波驅動藥物釋放
Figure 8 Ultrasound driven drug (tracer) delivery and release in vivo
(3) 細胞藥物釋放研究
于細胞實驗研究超聲波驅動藥物釋放的情形（如圖9）。
圖9細胞中以超聲波驅動Tracer釋放熒光物質
Figure 9 Ultrasound driven drug (tracer) delivery and release in vitro
產品3．Deliver
Deliver 產品主要是在Prime上負載臨床上化*用藥doxorubicin（DOX）的載藥微氣泡，使微氣泡除了可作為超聲造影劑以外，同時可達到超聲波驅動的藥物釋放和治療腫瘤的目的。Deliver較大優勢在于注入活體內后，能先利用微氣泡的顯影功能在超聲波影像上呈現腫瘤的位置，接著通過在目標位置加強超聲波可驅動Deliver內藥物在靶向部位大量釋放，達到腫瘤局部化*的功效。圖10顯示骨肉瘤上利用Deliver的治療結果：，在治療后第五天可以利用超聲波顯影劑觀察到腫瘤出現壞死（necrosis）。
圖10左圖為Deliver的熒光顯微鏡圖像；右圖為利用超聲波驅動Deliver釋放DOX進行治療，可以觀察到在治療后第五天腫瘤內部出現壞死
Figure 10 Left:Fluorescence microscopy image of deliver; Right: Tumor necrosis on day 5 after injection of Deliver.Labeler產品則是在Prime的殼層上修飾生物*分子（biotin molecules］或卵白素（avidin），使用者能鍵結上抗體，使微氣泡具專一性吸附能力之能力，能針對特殊位置進行專一性超聲波造影。圖11是在Labeler 上修飾anti-VEGFR2 antibody，可以觀察到微氣泡專一性的吸附于大量表達該抗體的癌細胞上。
圖11 在Labeler 上修飾 anti-VEGFR2 antibody，使微氣泡能大量且專一性的吸附于表達該抗體受體的癌細胞上
Figure 11 anti-VEGFR2 antibody labelled Labeler applied to targeting VEGF positive cancer cells產品5．Trans＋
Trans＋產品是在Prime的殼層材料上加入帶正電磷脂質材料，使微氣泡殼層帶有正電，使用者能以簡單的電性吸附原理，將帶負電的基因片段（DNA／RNA）吸附于微氣泡殼層上；再由超聲波驅動達到基因遞送及基因轉染（gene transfection）的功效。
圖12在Trans＋上吸附可以表達熒光的DNA，利用超聲波驅動基因釋放與轉染后可見轉染后的C6腦膠質瘤細胞均勻表達熒光
Figure 12 Full size Turbo Green absorbed Trans+ targeted to C6 glioma cells followed by the expression of turbo green
四、 目前已開展的應用研究
| 用途描述 |
| 豬左腳接肢后，以超聲波影像配合超聲造影劑觀察血流狀況，以確定接肢成功與否。 |
| 1．于小鼠腿部肌肉注射label有螢光的超聲造影劑，觀察微氣泡在肌肉組織的滯留時間與滯留范圍。2．基因轉殖細胞實驗，觀察超聲波與超聲造影劑的cavitation dose。 |
| 于腫瘤動物模型，靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波觀察腫瘤狀態。 |
| 于豬肢進行電燒后，靜脈注射超聲波對比劑，配合超聲波觀察電燒成功與否。 |
| 于微氣泡包覆藥物，配合超聲波進行藥物遞送。 |
| 于肥胖大鼠上，靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波進行肥胖檢測。 |
| 靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波，于肝癌模型進行典型癌癥pattern分析。 |
| 將螢光接上微氣泡作為model drug，并將微氣泡水溶液由耳道滴于耳膜上，配合特殊超聲波，進行藥物遞送（由耳膜遞送至中耳）。 |
| 以超聲造影劑配合超聲波，于細胞上進行基因轉殖。 |
| 以超聲造影劑配合高頻超聲波，進行高頻超聲波成像演算法開發。 |
| 以超聲造影劑配合HIFU，進行BBB-open，以及其后的藥物遞送和基因遞送。 |
| 于微氣泡包覆藥物，配合超聲波進行藥物遞送。 |
| 1．以超聲造影劑配合聚焦式超聲波，進行BBB-open，以及其后的藥物遞送和基因遞送。2．以超聲造影劑配合HIFU，于window-chamber模型進行傷害性評估。3．以超聲造影劑配合聚焦式超聲波進行物理參數與生物效應評估。4．直接利用微氣泡作為MRI對比劑。5．以MRI觀測微氣泡與HIFU之作用。 |
| 作為顯影劑開發的reference standard。 |
| 以超聲造影劑配合超聲波，進行成像演算法開發。 |
| 于小鼠肝癌模型，靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波觀察腫瘤血流狀態，進行新藥開發。 |
| 以超聲造影劑配合超聲波，進行動態細胞sonoporation觀測。 |
| 于微氣泡包覆藥物，配合超聲波進行藥物遞送。 |
| 利用微氣泡配合超聲波提升藥物輸送。 |
五、 文獻列表
1.S.T. Kang et al., "A Maleimide-Based In-Vitro Model for Ultrasound Targeted Imaging," Ultrasonics Sonochemistry, vol. 18, 2011.
2.C.H.Wang et al.,"Aptamer-Conjugated Nanobubbles for Targeted Ultrasound Molecular Imaging," Langmuir, vol. 27,2011.
3. S.T.Kang et al., "Intracellular Acoustic Droplet Vaporization in a Single Peritoneal Macrophage for Drug Delivery Applications,"Langmuir,vol.27,2011.
4.C.H.Wang et al., "Aptamer-Conjugated and Drug-Loaded Acoustic Droplets for Ultrasound Theranosis," Biomaterials, vol.33,2012.
5.S.T.Kang et al., "Ultrasound Microbubble Contrast Agents for Diagnostic and Therapeutic Applications: Current Status and Future Design," Chang Gung Medical Journal, vol. 35, 2012.
6.C.Y.Ting et al., "Concurrent Blood-Brain Barrier Opening and Local Drug Delivery Using Drug-Carrying Microbubbles and Focused Ultrasound for Brain Glioma Treatment," Biomaterials, vol. 33,2012.
7.P. Chonpathompikunlert et al., "Redox Nanoparticle Treatment Protects Against Neurological Deficit in Focused Ultrasound-Induced Intracerebral Hemorrhage," Nanomedicine, vol. 7,2012.
8.C. H. Fan et al., "Detection of Intracerebral Hemorrhage and Transient Blood-Supply Shortage in Focused-Ultrasound-Induced Blood-Brain-Barrier Disruption by Ultrasound Imaging," Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 38,2012.
9.C.H.Wang et al., "Superparamagnetic Iron Oxide and Drug Complex-Embedded Acoustic Droplets for Ultrasound Targeted Theranosis," Biomaterials, vol. 34, 2013.
10. C.H. Fan et al., "Antiangiogenic-Targeting Drug-Loaded Microbubbles Combined With Focused Ultrasound for Glioma Treatment," Biomaterials, vol.34, 2013.
11.C.H.Fan et al., "SPIO-Conjugated, Doxorubicin-Loaded Microbubbles for Concurrent MRI and Focused-Ultrasound Enhanced Brain-Tumor Drug Delivery," Biomaterials, vol. 34, 2013.
12.S.L.Peng et al., "Using Microbubbles as an MRI Contrast Agent for the Measurement of Cerebral Blood Volume," NMR in BioMedicine, doi: 10.1002/nbm.2988.NEW!
