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PCR反應被抑制或效率較低調(diào)整步驟

時間:2023/2/27閱讀:601
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一旦確定反應被抑制或效率較低,則可采取一些步驟將效率值重新調(diào)整到理想范圍內(nèi)。

 

1、對于抑制作用,可去除模板濃度最高的反應孔并重新分析標準曲線。如果效率重新回到110% 以下,則分析良好。

 

2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應延長干燥時間,以去除乙醇沉淀過程中的乙醇,或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

 

3、通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。此過程有時相對簡單,但在某些情況下,隨著分析復雜度的提高,優(yōu)化過程可能十分耗時費力。

 

4、擴增單個產(chǎn)物時,將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應效率,但當出現(xiàn)競爭作用時,則應降低鎂的濃度。

 

5、在某些情況下(主要是多重反應中),必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì)。此時,需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度,有時甚至還需檢測探針比值,以找出分析的理想濃度組合。最佳引物濃度介于100至600nM之間,而最佳探針濃度則在100nM至400nM 之間。

 

6、根據(jù)引物的Tm 值,確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當,且引物設計時使之有相似的Tm 值。


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