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PCR的反應條件:
因擴增片段的大小、反應體積、使用擴增儀器的不同而不同。
◇ 循環次數
根據模板DNA的量以及擴增片段的大小,設定25~30個循環。
如果循環次數太少,擴增量不足;如果循環次數太多,則會出現Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45~68℃之間 (預備實驗可2℃間隔進行)。另外,由于在60~68℃間,也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內設定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時,每kbp大體可設定30秒~1分鐘;當溫度設定在68℃以下時, 時間設定可稍長一些。通常,Anneal溫度太高,有時會得不到擴增產物;Anneal溫度太低時,容易發生非特異性反應。另外,Extension時間太短時,會得不到擴增產物或者會有一些短的非特異性產物優成;而Extension時間太長時,會出現Smear。?
參數規格:
產品名稱:鴨種特異性基因核酸檢測試劑盒
產品規格:50T
產品貨號:FS-P10226
產品分類:熒光PCR法
產品運輸:低溫運輸
儲存條件:-20℃避光保存,避免反復凍融。
運輸:低溫、避光,快遞免費送貨上門。
產品特點:
本產品就是根據保守區設計引物而開發的高靈敏 PCR檢測試劑盒 。
實驗過程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結束反應,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
b、內參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗di高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性*定量方法,已得到的*,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
無乳鏈球菌 蘭氏B群研究模式菌株: no病料提供形式: 凍干物安全等級: 2培養基: 396生長條件: 37
條紋擬盤多毛孢植物病原菌模式菌株: no散尾葵提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: 0014生長條件: 25-28℃
韓國假單胞菌大洋細菌模式菌株: no沉積物/深海沉積物提供形式: 凍干物安全等級: 1培養基: 471生長條件: 28℃
AS3.852產糖化酶。模式菌株: no種屬: Rhizopus│japonicus提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: CM0014生長條件: 28℃
淡紫擬青霉生長條件: 25培養基: 14提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no 定期移植法
蘇云金芽孢桿菌生長條件: 30℃培養基: 0002提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
-135℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
假諾卡氏菌培養基: 14模式菌株: no水中底泥提供形式: 斜面培養物;凍干物安全等級: 1生長條件: 25℃ -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法;礦物油法
毛柄金錢菌(金針菇)培養基: 0017食用菌提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 25℃ 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
微桿菌1.海洋石油污染生物修復; 2.生物活性物質篩選模式菌株: no沉積物/珊瑚砂顆粒提供形式: 凍干物安全等級: 1培養基: 821生長條件: 25℃
YIM61420模式菌株: no安全等級: 1種屬: Streptomyces│sp.植物提供形式: 凍干物培養基: 0038生長條件: 28℃
展青霉培養基: CM0017產生Griseofulvin灰黃霉素提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 28C 真空冷凍干燥
大腸埃希菌科研及血清定型模式菌株: no病料提供形式: 凍干物安全等級: 2培養基: 335生長條件: 37
-136℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
紅曲霉發酵,教學 紅曲菌(Monascus spp.)是我國重要的微生物資源,在我國已有上千年的使用歷史,被廣泛用于食品發酵劑、食品著色劑和中藥配伍的。由于紅曲菌在發酵過程中能產生多種具有活性的代謝產物:如紅曲色素、Monacolin類物質、γ-氨基丁以及多種酶類模式菌株: no紅曲米提供形式: 凍干物安全等級: 1培養基: 14生長條件: 28℃
水生黃桿菌生長條件: 20℃培養基: 848土壤提供形式: 凍干物模式菌株: no 真空冷凍干燥法
無機鹽瓊脂培養基250g紡織品防霉性能測試
MUGal(4-甲基傘形酮-β-半乳糖苷)肉湯基礎 100(g) incubation media MUGal(4-甲基傘形酮-β-半乳糖苷)肉湯基礎 100(g)
大腸桿菌&大腸菌群顯色培養基 E.Coli&Coliform Chromogenic Medium 1升 同時檢測大腸菌群和大腸桿菌,培養24小時,大腸桿菌顯紫色,大腸菌群顯紅色
改良MC培養基250incubationmedia改良MC培養基250
營養瓊脂 250g 霍亂弧菌傳代培養或純化培養
YM肉湯 YM Broth 250克 BR
土霉素葡萄糖酵母粉瓊脂基礎 OGY Agar 250克 霉菌、酵母菌分離培養和計數
華倫斯坦實驗室營養瓊脂 WL Nutrient Agar 250克 啤酒和發酵產品中酵母菌和細菌的計數
沙氏腦心浸液瓊脂 Sabouraud BHI Agar 250克 真菌檢測
鴨種特異性基因核酸檢測試劑盒1%NaCl甘露醇規格:20支詳情介紹
三糖鐵管規格:5ml*20支/包用途:用于腸桿菌科細菌的生化反應篩選
T1N3 肉湯規格:250g用途:用于霍亂弧菌的生長試驗(SN標準)
CDC厭氧菌瓊脂規格:250g用途:用于厭氧菌分離培養,使用時需添加羊血、化血紅素和維生素K1
抗生素檢定培養基1號(PH6.5-6.7)規格:250g用途:用于藥品抗生素效價測定
TSA表面接觸皿(6.5cm)規格:10個/包用途:用于環境、器皿、設備和表面的無菌檢測
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