測定意義

Hephaestin (HP)作為銅藍蛋白的同系物,是近年來發現的鐵轉運蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內鐵代謝。HP的表達可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調節。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+，在介導鐵的跨膜轉運中有重要作用。

測定原理：

HP催化Fe2+氧化為Fe3+，Fe2+和ferrozine反應顯色，在560 nm下有特征吸光值。通過測定Fe2+的減少速率可測得亞鐵氧化酶的活性。

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

1、細胞或組織樣品的制備：

培養細胞：先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細胞數量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

1.        加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。

3.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

4.        每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.       依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.       用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。