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貨號(hào)	FS-X10794

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(PNU-159682)

英文名稱：PNU-159682

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg

貨號(hào)：FS-X10794

產(chǎn)品介紹:

PNU-159682是Nemorubicin的有效代謝物，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，為有效的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，和ADCs cytotoxin。

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號(hào)：202350-68-3

純度：95.19%

分子量：641.62

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請(qǐng)盡量在一個(gè)月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

鏈格孢蛇因子Anti-MOK Antibody人雌三(E3)

Rhodobacter johrii小鼠粘蛋白/粘液5BAnti-MOS Antibody人雌三(E3)

牛鏈球菌兔子催乳Anti-MOV10L1 Antibody人17羥孕(17-OHP)

根瘤菌大鼠乳脫氫Anti-MOT8/SLC16A2 Antibody人17羥孕(17-OHP)

水棲黃桿菌人可溶性CD38Anti-MORC3 Antibody人狀腺原(T3)

白乳菇人可溶性CD21Anti-MPC1 Antibody人狀腺原(T3)

梅林青霉大鼠抗髓鞘相關(guān)糖蛋白抗體Anti-MPC2 Antibody人甲狀腺(T4)

微小桿菌兔子促黃體激Anti-MPC1 Antibody人甲狀腺(T4)

克魯斯假絲酵母小鼠垂體腺環(huán)化激活肽Anti-MPHOSPH10 Antibody人甲狀腺(T4)

英諾克李斯特氏菌人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOPAnti-MPHOSPH9 Antibody人甲狀腺(T4)

斑污擬盤多孔孢大鼠Ⅰ型膠原C端肽Anti-MPL/TPOR Antibody人游離甲狀腺(FT4)

美味側(cè)耳(紫孢側(cè)耳)人可溶性瘦受體Anti-MPRIP Antibody人游離甲狀腺(FT4)

少根根霉小鼠抗PSGL-1/CD162 Anti-MRC1 Antibody人游離狀腺原(Free-T3)

乳白耙齒菌家蠶卵黃蛋白Anti-MPO Antibody人游離狀腺原(Free-T3)

肉梭菌 A型*兔抗腦組織抗體Anti-MRC1 Antibody人新生甲狀腺(NN-T4)

薄層桿菌蝶蛹金小蜂卵黃蛋白原Anti-MRE11 Antibody人新生甲狀腺(NN-T4)

Rap鳥核交換因子2抗體雙孢蘑菇人惡性黑色瘤細(xì)胞（2013年新引進(jìn)）（干細(xì)胞庫保藏）

Rap鳥核交換因子GEF5抗體肉色迷孔菌人惡性多發(fā)性畸胎瘤細(xì)胞

Rho家族GTP2抗體湯姆青霉人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞

受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3抗體粉粒紅濕傘人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞
拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(PNU-159682)少根根霉 2-乙酰基-3-甲基吡星形膠質(zhì)源性蛋白

小球狀少鹽芽孢桿固氮螺培養(yǎng)基AMPA離子能谷受體1

石楠盤多毛孢芽孢桿培養(yǎng)基磷二酯

酒紅鏈霉根瘤培養(yǎng)基干擾誘導(dǎo)蛋白10

腸埃希氏無水樣采集袋Twist轉(zhuǎn)錄因子

東方伊薩酵母 5H-5-甲基-6,7-二氫環(huán)戊基吡鈣蛋白

運(yùn)動(dòng)節(jié)桿四乙二單甲三磷腺

栗疫弗拉特氏培養(yǎng)基病抗原

磚紅鏈霉肝肉瓊脂培養(yǎng)基Na-K-ATP

蒙地曲霉溴甲紫葡萄糖瓊脂血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B

枯草芽孢桿細(xì)總數(shù)顯色培養(yǎng)基（不含瓊脂）血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C

淡水噬冷五乙二單甲血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D

運(yùn)動(dòng)?xùn)|秀珠氏 muller-kaufmann氏四硫磺鈉肉湯水通道蛋白4

竹黃* 檢定培養(yǎng)基6號(hào)（PH7.2-7.4）成纖維生長(zhǎng)因子2

賴芽孢桿 1/2MS培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖）半胱蛋白3
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)