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PCR的反應條件:
因擴增片段的大小、反應體積、使用擴增儀器的不同而不同。
◇ 循環次數
根據模板DNA的量以及擴增片段的大小,設定25~30個循環。
如果循環次數太少,擴增量不足;如果循環次數太多,則會出現Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45~68℃之間 (預備實驗可2℃間隔進行)。另外,由于在60~68℃間,也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內設定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時,每kbp大體可設定30秒~1分鐘;當溫度設定在68℃以下時, 時間設定可稍長一些。通常,Anneal溫度太高,有時會得不到擴增產物;Anneal溫度太低時,容易發生非特異性反應。另外,Extension時間太短時,會得不到擴增產物或者會有一些短的非特異性產物優成;而Extension時間太長時,會出現Smear。?
參數規格:
產品名稱:塞尼卡谷病毒(SVV)核酸檢測試劑盒
產品規格:50T
產品貨號:FS-P10369
產品分類:熒光PCR法
產品運輸:低溫運輸
儲存條件:-20℃避光保存,避免反復凍融。
運輸:低溫、避光,快遞免費送貨上門。
產品特點:
本產品就是根據保守區設計引物而開發的高靈敏 PCR檢測試劑盒 。
實驗過程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結束反應,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
b、內參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗di高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性*定量方法,已得到的*,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
雞縱菌生長條件: 25培養基: 14提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no 定期移植法
鏈孢囊菌 真空冷凍干燥法生長條件: 28℃提供形式: 凍干物模式菌株: yes培養基: 38
-427℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
瓣鰓紅酵母產酶微生物/淀粉酶模式菌株: no生物樣/tubeworm提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: 513生長條件: 28℃
鏈格孢霉屬培養基: CM0014抗癌活性提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 28C 真空冷凍干燥
草菇培養基: 0017食用提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 30℃ 液氮超低溫凍結法;礦物油法
擬盤多毛孢培養基: 0014模式菌株: no植物提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 18-26℃ 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
尖鐮孢萎蔫專化型(棉花枯萎病菌)生長條件: 25℃培養基: 0014提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no
藍色鏈霉菌培養基: 0039模式菌株: no土壤提供形式: 斜面培養物安全等級: 1生長條件: 20℃ 液氮超低溫凍結法;礦物油法;定期移植法
-428℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
靈芝培養基: 0014食用 藥用提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 25℃ -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法;礦物油法
AS3.3658轉化甾體激素模式菌株: no種屬: Fusariumequiseti花菜籽安全等級: 1培養基: 14,17生長條件: 25~28℃
出芽短梗霉生長條件: 28℃培養基: 14提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no 定期移植法
冷海水黃桿菌培養基: 470模式菌株: no土壤提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 18℃ 真空冷凍干燥法
大腸埃希氏菌培養基: 33基因工程常用菌提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no生長條件: 37℃ -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法
外來毛霉培養基: 0014模式菌株: no土壤提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 25-28℃ 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
高錄(*)¤Perchloric acidAR500ml
SM1253MassRuler Express HR Reverse DNA Ladder, ready-to-use194
L3625-1KGL+ Lactose L-乳糖63-42-31kg
Kisser封片液10ml
Metronidazole25g
乙乙酯¤etxyl acetateGCS2ml
SM0373GeneRuler 50bp DNA Ladder, ready-to-use174
P2250-25GVitamin B5 維生素B5(D-泛鈣)137-08-625g
CTAB250g
α-Amylase, Bacillus Licheniformis1g
大鼠葉(FA)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
人小扁結合型甲胎蛋白/甲胎蛋白異質體1(AFP-L1)免疫試劑盒 Human alpha-fetoprotein Lens culinaris aggliin 1,AFP-L1 ELISA Kit
γ-谷酰半胱連接酶(GCL)測試盒 可見分光光度法 50管/48樣
RatMelatonin,MT/MLTELISA試劑盒大鼠褪黑素(MT/MLT)ELISA試劑盒規格:96T/48T
HumanheparincofactorⅡ,HCⅡELISA試劑盒人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)ELISA試劑盒規格:96T/48T
Humanliverkidneymicrosomeaoaibody,LKMELISAKit人抗肝腎微粒體抗體(LKM)ELISA試劑盒規格:96T/48T
塞尼卡谷病毒(SVV)核酸檢測試劑盒山梨醇規格:20支詳情介紹
解磷細菌培養基(有機磷細菌培養基)規格:250g用途:用于利用有機磷細菌的分離培養
LB瓊脂(lennox)規格:250g用途:用于分子生物學中大腸桿菌的培養
缺陷假單胞菌培養液(SLB肉湯)規格:250g用途:主要用于過濾膜的檢測。
棉子糖發酵管規格:1ml*20用途:用于生化鑒定
腸球菌顯色培養基規格:1000ml用途:用于腸球菌的顯色培養,腸球菌顯紅色至紫紅色
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