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DyLight 594是一種橙紅色熒光團,其zui大吸收波長在593nm,相應的zui大發射波長是618nm。DyLight熒光染料是通過將磺酸酯加成到香豆素、呫噸類 (如FITC和羅丹明)以及花箐素類熒光染劑上而成,磺酸酯使DyLight帶負電荷并呈親水性。與傳統的熒光團,如FITC、羅丹明以及Cy3和Cy5 等相比,DyLight熒光染料具有較寬的激發和發射波段,幾乎覆蓋了所有的可見光區域,包括藍色、綠色、黃色、橙色、紅色,以及近紅外和遠紅外波段,因 此可用于大部分熒光顯微鏡以及遠紅外成像系統。并且與傳統的熒光團相比,具有發光亮度更強,靈敏度更高,背景更低的優勢,同時其對pH的穩定性更好,發光 也更持久,因此更適合于拍照。DyLight熒光熒光染料作為熒光顯微鏡、細胞生物學和分子生物學內的生物分子、細胞和組織標記物,可應用于生物技術和研 究等眾多領域。
Cy2耦聯基團激發波長為492nm,發光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片,但是要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑,因為這種抗淬滅劑和Cy2反應,在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。Cy2屬于花菁類染料 (Cyanine Dyes),常見的Cy系列染料主要包括有Cy2、Cy3、Cy5等,能與細胞內蛋白質結合。這類染料的熒光特性與傳統熒光素類似,但水溶性和對光穩定性較強,熒光量子產率較高,對pH等環境不敏感。常用于多重染色。與FITC相比,Cy2的熒光強度更大,光穩定性和抗萃滅性更好。
FITC(Fluorescein Isothiocyanate,異硫氰酸熒光素)純品為黃色或橙黃色結晶粉末,易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4,zui大吸收光波長為 490~495nm,zui大發射光波長為520~530nm,呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,是目前應用zui廣泛的熒光素。由于 FITC是小分子化合物,每一個抗體可標記幾個FITC分子,IgM通常用小分子的熒光素標記,如FITC、Cy3/5、Texas Red等。然而FITC的zui大缺點是淬滅快,因此要和抗淬滅劑一起使用。FITC性質穩定,能與蛋白質結合,是檢測組織細胞內蛋白質zui常用的熒光探針。它 還能標記抗體,可用于免疫組織化學單染或多重染色。FITC熒光二抗主要優點是人眼對黃綠色較為敏感,通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。缺點是在光照下 易淬滅,易受自發熒光影響。
Cy5zui大激發光波長為649nm,zui大發射光波長為680nm,呈紅色熒光。Cy5屬于花菁類染料(Cyanine Dyes),常見的Cy系列染料主要包括有Cy2、Cy3、Cy5等,能與細胞內蛋白質結合。這類染料的熒光特性與傳統熒光素類似,但水溶性和對光穩定性較強,熒光量子產率較高,對pH等環境不敏感。常用于多重染色。Cy3可以和熒光素一起作雙標。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮,更穩定,背景更弱。由于Cy5的zui大發射波長為680nm,很難用裸眼觀察,而且不能使用高壓汞燈作為理想的激發光源,因此,使用普通熒光顯微鏡時,不推薦使用Cy5。通常觀察Cy5時需使用激光掃描共聚焦顯微鏡。
TRITC(Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate,四甲基異硫氰酸羅丹明)是羅丹明的一種衍生物之一,呈紫紅色粉末,較穩定。羅丹明的衍生物還包括Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)等。這些羅丹明衍生物的耦聯基團具有不同的吸收波長 (550, 570, 596nm)和zui大發射波長(570, 590, 620nm)。TRITC熒光素能與細胞內蛋白質結合,比FITC穩定性好,在生理條件下對pH值變化不敏感,熒光強度受自發熒光干擾小。TRITC的zui 大激發光波長為550nm,zui大發射光波長為620nm,呈橙紅色熒光,與FITC發出的黃綠色熒光對比鮮明,常用于免疫熒光組織化學雙重染色。因其熒光 淬滅慢,也可用于單獨標記染色。需要注意的是,因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發, 在流式細胞儀中用FITC作雙標,另一種用藻紅蛋白(PE)耦聯基團要比羅丹明好。
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