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上海金穗生物科技有限公司
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雜交瘤技術的基本原理

時間:2012/9/15閱讀:767
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雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠B細胞和小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長(選擇原理見后),小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖,即所謂永生性。在選擇培養基的作用下,只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續增殖的能力,形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。其原理從下列3個主要步驟闡明。

 
    (一)細胞的選擇與融合
    建立雜交瘤技術的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體,所以融合細胞一方必須選擇經過抗原免疫的B細胞,通常來源于免疫動物的脾細胞。脾是B細胞聚集的重要場所,無論以何種免疫方式刺激,脾內皆會出現明顯的抗體應答反應。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖,只有腫瘤細胞才具備這種特性。·選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發性骨髓瘤是B細胞系惡性腫瘤,所以是理想的脾細胞融合伴侶。
    使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷,使細胞易于相互粘連而融合在一起。佳的融合效果應是低程度的細胞損傷而又產生高頻率的融合。聚乙二醇(PEG1 000~2 000)是目前常用的細胞融合劑,一般應用濃度為40%(W/V)。
 
    (二)選擇培養基的應用
    細胞融合是一個隨機的物理學過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸液中,經融合后細胞將以多種形式出現。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養基中僅存活5~7d,無需特別篩選;細胞的多聚體形式也容易死去;而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。
    細胞DNA合成一般有兩條途徑。主要途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸,進而合成DNA,*作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下,經次黃嘌吟磷酸核糖轉化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。細胞融合的選擇培養基中有3種關鍵成分:次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、*(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T),所以取三者的字頭稱為HAT培養基。*是*的拮抗劑,可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成DNA,而融合所用的瘤細胞是經毒性培養基選出的HGPRT-細胞株,所以不能在該培養基中生長。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能,可在HAT培養基中長期存活與繁殖。
 
    (三)有限稀釋與抗原特異性選擇
    在動物免疫中,應選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇,一個動物體在受到抗原刺激后產生的體液免疫應答實質是眾多B細胞群的抗體分泌,而針對目標抗原表位的B細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程,在已經融合的細胞中有相當比例的無關細胞的融合體,需經篩選去除。篩選過程一般分為兩步進行:一是融合細胞的抗體篩選,二是在此基礎上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞進行充分稀釋,使分配到培養板的每一孔中的細胞數在0至數個細胞之間(30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞),培養后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細胞;這一過程常被習慣地稱作克隆化。將這些陽性細胞再進行克隆化,應用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標抗原的抗體陽性細胞株,增殖后進行凍存、體外培養或動物腹腔接種培養。

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