（1）樣品洗畢，重懸于含1％正常羊IgG的PBS中。在1．5m1錐形管中胚胎或其他樣品所占體積應少于50fJl，或在5mlsnap-top管中應少于200fil。搖動孵育1h。
在此方法中，以非免疫動物的羊IgG作為封閉劑，即從正常羊血清中通過蛋白G純化制備。因本文推薦的標記二抗是羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白抗體，故選擇羊IgG作為封閉試劑。如使用的是另一來源的標記二級試劑，則應改用其他封閉劑，如可選用3％牛血清白蛋白。
（2）用PBS洗樣品2次。
（3）加一抗：用含蛋白質的溶液進行抗體稀釋。例如，用含1％正常羊IgG的PBS。
單克隆抗體選用雜交瘤細胞培養上清（特異性抗體濃度為20-50us／mi；以1：10稀釋度作起點為佳）。小鼠腹水，純化的單克隆抗體和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應測試一定范圍內的稀釋度，從而使特異性抗體濃度達到o．01～1Ps／ml。如果特異性抗體濃度是未知的，制備并測試初始制品的不同稀釋度（1：10，1：100，1：1000和1：10 000）。
在果蠅類標本的抗原分析中常使用雙標記方法，詳見第五章。異硫氰酸熒光素（FITC）和德克薩斯紅（Texas red）是一對很好的試劑，由于FITC標記抗體所發出的熒光更強，因而可用來染色較難檢測的抗原。
（4）在4℃孵育樣品24h。
（5）用PBS洗樣品3次，每次5min以上。該緩沖液中可含1％TritonX—100或NP-40，以降低背景。
（6）加熒光染料標記的二抗試劑：用含蛋白質的溶液如1％正常羊IgG／PBS制備各種稀釋度。常用的二抗試劑包括抗免疫球蛋白抗體、蛋白A和蛋白G。一般而言，建議使用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白二抗。標記的二抗可以購自供應商，如果使用商業來源的標記二級試劑，其稀釋度可從1：50至1：1000。堿性磷酸酶標記的試劑應用Tris緩沖液稀釋，而不用PBS。
（7）與標記的二抗試劑在4℃孵育至少1h。
（8）用PBS洗樣品3次，每次5min。該緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以降低背景。
（9）優化選擇：當在高倍鏡下觀察胚胎時，胚胎的直觀視覺模式和通過胚胎的光路長度常引起樣品出現不透明的現象。為了克服這一特點，通常用不同的試劑處理胚胎，這樣可改變胚胎的折射指數。可將胚胎在甘油或甲基水楊酸鹽溶液中孵育。對于大多數染色標本而言，甘油效果較好。
將胚胎重懸于500u1的甘油／PBS（50：50）混合液中，于室溫下孵育1h。
離心胚胎，重懸于70：30的甘油／PBS混合液中。
經過甲基水楊酸鹽溶液處理的標本清晰度比甘油更好，但其易揮發，使一些工作者難于忍受這種氣味。此外，它沒有黏度，使得對胚胎的處理容易。可先將胚胎通過一系列乙醇處理：50％乙醇5min，70％乙醇5 min，90％乙醇5 min，100％乙醇5 min，各2次。加500~1甲基水楊酸鹽溶液，作用10 mm，不要搖動試管。胚胎將沉到底部。去除上清并加新鮮的甲基水楊酸鹽溶液。后用甘油代替甲基水楊酸鹽溶液。
（10）使用共聚焦顯微鏡觀察并記錄圖像。為了正確使用該儀器，工作者應參考這一特殊儀器的使用說明。關于共聚焦顯微鏡的一般性討論，參見Spector等（1998）。
