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上海金穗生物科技有限公司
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酶聯(lián)法檢測梅毒螺旋體抗體

時間:2012/10/12閱讀:1238
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[檢測方法]  ELISA法

    [方法學(xué)原理]  用精制的基因工程表達(dá)的梅毒螺旋體特異性抗原包被固相載體,加患者血清后,如患者血清中有相應(yīng)抗體,可形成抗原抗體復(fù)合物。在此基礎(chǔ)上加入酶標(biāo)記抗原,即可形成抗原—抗體—酶標(biāo)記復(fù)合物。再加入酶底物,底物經(jīng)酶分解后顯色,即為陽性反應(yīng)。反之,若患者血清中無相應(yīng)抗體,則酶標(biāo)記抗原就不能與包被抗原相結(jié)合,從而加入酶底物不會顯色,此為陰性反應(yīng)。
    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  靜脈血2ml,不抗凝。
    [試劑]
    1.TP酶標(biāo)板
    2.TP陽性對照
    3.TP陰性對照
    4.TP酶標(biāo)試劑
    5.顯色劑A
    6.顯色劑B
    7.終止液
    8.濃縮洗滌液
    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。
    [檢測步驟]
    1.配制洗滌液  將50ml濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋至1 000ml備用。
    2.根據(jù)標(biāo)本數(shù)量,將酶標(biāo)板條固定于板架上,每板設(shè)陰性對照2孔,陽性對照2孔,空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步相同)。
    3.加酶  每孔加100gl酶標(biāo)試劑。
    4.加樣  分別在相應(yīng)孔中加入待檢樣品,陰性對照、陽性對照20u1,振蕩混勻。
    5.溫育  用封板膜封板后,置37℃環(huán)境中溫育60min。
    6.洗滌  小心將封板膜揭掉,用洗滌液充分洗滌6遍,后一次盡量拍干。
    7.顯色  每孔加顯色劑A、B各50ul,輕輕混勻,用封板膜封板后置37℃環(huán)境中避光顯色15min。  
    8.測定  每孔加終止液50gl,混勻,以空白調(diào)零點,用酶標(biāo)儀450nm波長測定各孔OD值。
    [結(jié)果判定]
    1.臨界值(cutoff)計算cutoff=陰性對照孔OD均值+0.18。
    2.陽性判定  樣品OD值≥cut off值為梅毒螺旋體抗體陽性。
    3.陰性判定  樣品OD值
    [正常參考值]  TPAb陰性
    [注意事項)
    1.檢測必須符合實驗室管理規(guī)范和生物安全守則的規(guī)定。操作時必須戴手套、穿工作服,嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離制度。所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
    2.梅毒螺旋體抗體檢測結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),在正常情況下,本試驗陰性對照孔OD值應(yīng)≤0.10,陽性對照孔OD值應(yīng)≥0.80。若陰性對照>0.10,應(yīng)查明原因,必要時應(yīng)重新操作。
    3.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)置室溫環(huán)境中平衡15~30min后再用,未用完的微孔條用自封袋密封保存。
    4.洗滌液可用蒸餾水或去離子水配制。洗滌時各孔均需加滿洗滌液,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈,使用洗板機洗滌時應(yīng)設(shè)置30~60s的浸泡時間。
    5.不同批次試劑不能混用,封板膜為一次性用品,不能重復(fù)使用。
    [臨床意義]  以梅毒螺旋體為抗原檢測血清中特異性抗體,敏感性高,特異性強,是目前較好的檢測方法。陽性見于梅毒螺旋體感染,但此類抗體除IgM外,即使經(jīng)過足量抗梅毒治療,仍能在患者體內(nèi)持續(xù)存在甚至保留終身,因此不適于觀察療效、復(fù)發(fā)及再感染。但經(jīng)治療后,IgM比抗心磷脂抗體消失快。因此,TP-IgM的存在是活動性梅毒的一個重要指征。
    1期梅毒(硬性下疳,感染后l至數(shù)周)陽性率FTA—ABS為81%~87%,TPA為50%~60%,RPR為68%~76%,早期診斷TPA敏感性較低。2期梅毒(感染后8—10周左右),F(xiàn)TA-ABS、TPA和RPR陽性率均可達(dá)99%~100%。晚期及隱性梅毒FTA—ABS和TPA陽性率95%~100%,RPR下降至66%~68%。
    除梅毒螺旋體感染外,一些非梅毒螺旋體感染如品他、雅司等熱帶性密螺旋體感染癥,口腔、齒槽及眼結(jié)膜等密螺旋體感染癥亦可呈假陽性;SLE血清存在的抗核抗體,F(xiàn)TA-ABS可呈假陽性反應(yīng)。
    以RPR為代表的梅毒血清學(xué)非特異性反應(yīng)和以TP-Ab為代表的梅毒血清學(xué)特異性反應(yīng)在臨床應(yīng)用上各有其優(yōu)缺點,二者可聯(lián)合使用。其結(jié)果解釋見表。
梅毒血清學(xué)檢查的比較
    梅毒血清學(xué)試驗方法較多,無論哪一種方法其敏感性和特異性都達(dá)不到100%。因此,對可疑病例應(yīng)采用2~3種方法聯(lián)合使用,以提高診斷的正確率。

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