有多種不同的方法可使抗原有效地結合到免疫親和柱上。因為抗體是通過共價與微珠偶聯，而不是在溶液中，抗體—微珠／抗原作用完成所需的時間比抗體和抗原二者以游離狀態在溶液中所需的時間要長得多。因此，采用的方法應使抗原交連的抗體達到大程度的結合。推薦使用兩種結合方法：將抗原溶液加入呈糊狀的抗體—微珠內不斷混和均勻；或將抗原溶液流經抗體—微珠層析柱，保持抗原與抗體盡可能長時間的接觸。如沒有別的問題，應首先選擇在抗體—微珠柱內結合。若是結果不夠理想，可以試用在溶液中結合的方法。先用幾支小型層析柱測試佳結合和收集抗原的條件。

1．親和力
雖然抗體對抗原的親和力可以計算，但對大多數工作來說，決定性的標準是抗體是否可以將抗原從溶液中定量地分離出來。簡單的方法是建立一個小規模的反應，測試初洗滌液中抗原的含量。如果抗體—微珠基質在l一2h內不能分離大多數抗原，在實驗設計時做一些變動，可能會有些幫助。使微珠上偶聯較多的抗體或增加微珠的用量抑或延長結合時間，可以使結合的抗原量增加。但這些條件會增加非特異性本底，所以一般應綜合考慮獲得高產量和低本底的條件，另一方面，使用高親和力的抗體可以解決有效收集抗原的問題。其次使用稀釋的溶液，相對較低的濃度和較短的結合時間，這些條件都可使本底降低。

2．滴定
作為測定的*個步驟，先確定所需柱基質與結合給定量抗原的比值。方法與免疫沉淀法相同。將等體積的抗體—微珠基質加到含不同濃度抗原的樣本中，糊狀物在4C混合1h，以后過程同標準免疫沉淀試驗。這樣就可以得出關于收集所需抗原必要的分離柱基質體積的估計量。如果從結合反應的上清液中測得抗原，也可以測定被除去的無關抗原量。

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