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上海金穗生物科技有限公司
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gⅥ-cDNA噬菌粒文庫的獲取和純化

時(shí)間:2013-3-11閱讀:340
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 [方法]
A.噬菌體顆粒文庫的獲取
1.在lOOml的搖瓶中加50ul的甘油菌(8X108個(gè)細(xì)胞)到20m1的LBAT,在37℃振蕩(260r/min)培養(yǎng)2~3小時(shí)(或OD600nm達(dá)到0.5~0.7)。
2.在感染多樣性為10:1的條件下加R408輔助噬菌體。
3.在37℃無振蕩條件下溫育細(xì)胞30分鐘。
4.將已感染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到加有l(wèi)OOml預(yù)加熱的LBAT的1 L搖瓶中。
5,在30℃振蕩(260 r/min)條件下過夜培養(yǎng)。
B.噬菌體顆粒文庫的純化
1.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml聚乙烯管中,并在4℃3500g條件下離心30分鐘。
2.用0.45um過濾器濾除上清液(用一個(gè)新的聚乙烯管),并加1/5體積的PEG/NaCl。
3.混合均勻,在冰浴中培養(yǎng)1小時(shí)。
4.在4℃,3500g的條件下離心20分鐘,除去上清液然后在4℃,4000g的條件下離心3分鐘,后盡量除去上清液。
5.在0.5ml的PBS和5%(體積分?jǐn)?shù))的無菌甘油中打散沉淀,再一起轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微離心管中。
6.在14000g微離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)以除去細(xì)胞碎片,將上清液轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中。
7.通過檢測260nm的吸收值來計(jì)算噬菌體的濃度,一吸收單位相當(dāng)于4.4×1013個(gè)噬菌體轉(zhuǎn)化單位。
8.為了儲存在新的微離心管中將噬菌體均等分為250ul,在-20℃冷凍并儲存。

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