一、準備和安裝過濾器 

清洗好過濾器，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包好，用15磅20min進行高壓滅菌處理。在超凈臺內打開并將過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中，用泵過濾后檢查濾膜是否完好。 

二、合成培養基的配制：

1.根據細胞目錄中的說明，按表選擇合適品牌及貨號的培養基干粉，用適量超純水充分溶解。

2.按要求添加tan酸氫鈉、gu氨酸鈉等，充分攪拌使之溶解。

3.pH調至7.2左右。

4.加水至zui終體積。

5.在超凈臺中對溶液進行濾過除菌，分別裝入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。

6.瓶口封存好，放入4℃的冰箱進行貯存。 

三、小牛血清的處理 

1.將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。

2.處理后的血清貯存于4℃。

3.小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質量。

四、生長培養基的配制 

1.除了無血清培養之外，各種合成的培養基在使用之前都需要加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 

2.培養基分裝成小瓶（100～200 mL）以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。 

比例配制：基本培養基占80％--90％，小牛血清或胎牛血清占10％--20％。按1％的體積分數加入雙抗貯存液（qing霉素+lian霉素），使qing霉素和llian霉素的終濃度分別為100U／mL和100μ／mL，。 

五、凍存細胞的復蘇 

1.應遵循慢凍快融的原則。先將水浴鍋調至37-37.5°，取出凍存的細胞迅速放入后將細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化。 

2.在無菌臺內將培養基加入到50ml的小培養瓶內，約5ml左右，然后用無菌吸管從凍存管內取出細胞，置培養并內輕輕搖晃，使細胞均勻后置培養箱內培養。

六、傳代 貼壁細胞:

對于貼壁細胞應先吸/倒 進培養基，吸干凈，以免中和后加入的消化液使強度減弱。50ml培養瓶加入消化液約1-3ml，晃動使消化液鋪均勻置37°培養箱約2-5分鐘，鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落后，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml培養基后，輕輕吹打，使細胞基本成單個懸浮，然后分置其它無菌培養瓶內，加入培養基后繼續培養或實驗。 

七、凍存 

將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以培養基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106ml。加入10%的DMSO。以每管1-2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70°C的冰箱冷凍。次日保存到液氮中。 

八、注意事項

玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒:

1）高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;

2）干烤消毒140度2小時以上; 

3）無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;

4）各種培養板照射3小時以上; 

培養基（pH7.2）和血清配制好后要做無菌試驗:

1.將血清按10%加入培養基內，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存; 

2.消化液（pH7.8）或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存;

3.培養箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌）。至少每月一次。 

進入操作時應注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時注意無菌臺內空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方，如果數量較多，培養瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應相隔一定的距離，開瓶時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒，打開后先用燈先燒口，再燒蓋。用完后同樣操作。整個操作過程需靠無菌臺近點。