小鼠p53(p53)elisa試劑盒操作基本步驟：

1、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加樣：加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。*設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請精確 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時(shí)，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7、 底物：底物請避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

小鼠p53(p53)elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)意事項(xiàng)

1.血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時(shí)間保存，應(yīng)在-70℃以下。

2.在使用微量加樣器時(shí)，吸取不同瓶子中液體后要更換槍頭，即使吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.吸取液體時(shí)速度不易太快，以免產(chǎn)生氣泡，吸取的量不夠準(zhǔn)確。

4.樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶可能會(huì)對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶，如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。1．5 吸取液體時(shí)要選用量程和需要量接近的微量加樣器吸，減少誤差。

5.液體全部加入酶標(biāo)孔后，將酶標(biāo)板放在桌子上平行輕輕搖晃30s，使液體充分混合均勻，也使其得到充分的反應(yīng)。

6.孵育時(shí)要使蓋板膜封好酶標(biāo)板，防止水分蒸發(fā)，以防曲線不成線性。

7.實(shí)驗(yàn)前30min將試劑盒中的所有試劑從冰箱取出，使試劑盒中的所有試劑與提取好的樣品溶液的溫度相同，酶標(biāo)板只要取出所需量。

8.由于底物顯色劑對光及其敏感，因此要避光保存。

要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色

9.手工洗板時(shí)每次加入洗滌液后。應(yīng)靜置15～30s，不要將一個(gè)酶標(biāo)孑L中的洗滌液濺入另一酶標(biāo)孔中，防止交叉污染。甩去洗滌液后將酶標(biāo)板放在毛巾或吸水紙上拍干。

10.檢測吸光度前應(yīng)將酶標(biāo)儀打開，將其預(yù)熱30min以上。

11.底物為TMB，避免與皮膚相接觸。終止液為2tool的濃**具有腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸皮膚。

12.孵育的時(shí)間應(yīng)該嚴(yán)格按照試劑盒說明書上的時(shí)間為準(zhǔn)。

13.要盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才既能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，又能反映出試劑盒的精密度。

14.冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。

15.對樣本的結(jié)果有疑問時(shí)需要使用其他檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證。

16.沒有去離子水或雙蒸水時(shí)，可以使用娃哈哈純凈水配制溶液，切勿使用自來水。

17.標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。

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