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ELISA間接法實驗操作步驟

時間:2022/8/8閱讀:3864
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ELISA間接法實驗操作步驟:

1、抗原包被過夜(12h以上): IgG抗原,用包被液(CBS)稀釋,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置過夜。

抗原用量:0.1μg*100N/抗原濃度 (N為板數)
2、封閉:棄上清 加300μL/孔封閉液,37℃放置2h。
3、洗滌:用洗滌液洗3次
4、加一抗(待測樣品為細胞培養(yǎng)上清):將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清100μL /孔加到已包被的板上,空白培養(yǎng)基作為陰性對照,已知樣品血清(1:200稀釋于1%BSA+PBST中)作為陽性對照。37℃恒溫箱溫育2h。
測免疫效價待測樣品為小鼠血清時:采小鼠血液于常溫20min左右后放4℃至析出血清,3000r 10min離心。將含抗體的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST連續(xù)倍比稀釋(按照1:200開始),100μL /孔。每個樣品平行做兩份,小鼠陰性血清或空白培養(yǎng)基作為陰性對照,已知樣品作為陽性對照。37℃恒溫箱溫育2h。
5、洗滌:用洗滌液洗5次。
6、加二抗(酶標抗抗體):羊抗鼠IgG-HRP,用1%BSA+PBST l :10000稀釋,100μL/孔, 37℃恒溫箱溫育1h。
7、洗滌:用洗滌液洗5次,
8、顯色:加新鮮配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔,37℃恒溫箱放置10min,顯示藍色。
9、終止反應、比色:加30μL/孔H2SO4終止液.顏色變黃;用酶標儀測定450nm  630nm處各孔的吸光值,陽性反應的最大稀釋度為待測樣品的效價。



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