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?變性瓊脂糖凝膠電泳測定過程

時間:2023/1/29閱讀:744
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   實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。  變性瓊脂糖凝膠電泳測定過程:

1、制膠
1 g瓊脂糖溶于72 ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% jia醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS電泳緩沖液
濃度  成分
0.4 M  MOPS,pH 7.0
0.1 M  乙酸鈉
0.01 M  EDTA 
灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內(nèi),加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

2、準備RNA樣品
取3 ugRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
 
3、電泳
 上樣前凝膠須預電泳5 min,隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。
 
4、紫外透射光下觀察并拍照 
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。

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