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PCR反應假陰性,不出現擴增條帶分析

時間:2024/8/19閱讀:368
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      PCR反應常出現假陰性,不出現擴增條帶現象,PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量, ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質,②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹di。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。
酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20μl、30μl、50μl或100μl,應用多大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20μl后,再做大體積時,一定要重新摸索條件,否則容易失敗。
物理原因:溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率;退火溫度過高,影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下PCR儀或水浴鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

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