肉毒桿菌E/F型（CB-E/F）雙重熒光PCR法優點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結果。

③檢測結果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結果會出現假陽性。（可用培養法做補充驗證）

②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大（由于引物及內在設計不同），需謹慎選擇，盡量在業人員推薦指導下使用。

組成及試劑配制:

1、酶標板：一塊（96孔）

2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

【質量控制】

              1．陰性對照：Ct 值＞38 或未檢出。

              2．陽性對照：擴增曲線呈 S 型，且 Ct 值≤30。

              3．同一實驗以上要求需同時滿足，否則本次實驗視為無效。

              4．每種檢測靶標都需設陰陽對照，不同的靶標根據對應陰性調整基線閾值。

【結果判讀】

              1．FAM 通道檢測 B 組鏈球菌。

              2．陰性：Ct 值＞38 或未檢出。

              3．陽性：擴增曲線呈 S 型，且 Ct 值≤35。

              4．可疑：擴增曲線呈 S 型，且 35＜Ct 值≤38，需復檢；復檢結果若一致，判定結果為陽性。

【檢驗方法的局限性】

              1．樣品采集、運輸、保存不當，試劑運輸、保存、配置不當都可能會影響實驗結果，甚至會導致假陰性結果。

              2．如果實驗室污染、試劑污染、樣品交叉污染，可能出現假陽性結果。

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