對蝦肝腸孢子蟲病（EHP)熒光PCR法優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點(diǎn)：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

組成及試劑配制:

1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

【質(zhì)量控制】

              1．陰性對照：Ct 值＞38 或未檢出。

              2．陽性對照：擴(kuò)增曲線呈 S 型，且 Ct 值≤30。

              3．同一實(shí)驗(yàn)以上要求需同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)視為無效。

              4．每種檢測靶標(biāo)都需設(shè)陰陽對照，不同的靶標(biāo)根據(jù)對應(yīng)陰性調(diào)整基線閾值。

【結(jié)果判讀】

              1．FAM 通道檢測 B 組鏈球菌。

              2．陰性：Ct 值＞38 或未檢出。

              3．陽性：擴(kuò)增曲線呈 S 型，且 Ct 值≤35。

              4．可疑：擴(kuò)增曲線呈 S 型，且 35＜Ct 值≤38，需復(fù)檢；復(fù)檢結(jié)果若一致，判定結(jié)果為陽性。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

              1．樣品采集、運(yùn)輸、保存不當(dāng)，試劑運(yùn)輸、保存、配置不當(dāng)都可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至?xí)?dǎo)致假陰性結(jié)果。

              2．如果實(shí)驗(yàn)室污染、試劑污染、樣品交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

公司正在出售的產(chǎn)品：