組成及試劑配制:
1、牛型放線菌PCR檢測試劑盒說明書酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

樣本采集、存放及運輸：
1、牛型放線菌PCR檢測試劑盒說明書樣本采集：各類型樣本按照常規方法采集；
2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（多凍融3次）；
3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
【標本要求】
牛型放線菌PCR檢測試劑盒說明書人體鼻腔或咽部分泌物:用無菌捻拭子拭取鼻腔或咽部分泌物，將分泌物或咽拭子置入無菌玻璃管（含0.4ml滅菌生理鹽水），用無菌棉球將試管塞緊后，密閉送檢。標本可立即用于檢測，也可保存于-20℃待測。
【檢驗方法】
1.標本、對照品的核酸裂解處理
用商品化（取得醫療器械許可證）的RNA提取試劑盒處理標本，具體操作參見該試劑盒說明書。
或用Trizol法提取，方法如下：取100?l樣品置于1.5ml 離心管中，加入300?l裂解液（Trizol），再加入100， 混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒混勻15次； 13000rpm離心15min， 吸取上層液體，加入等體積異丙醇，顛倒混勻室溫靜置10min， 13000rpm離心10min，輕輕倒去上清；加入700?l 75%乙醇，顛倒洗滌，13000rpm離心5min，輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，棄盡液體或4000rpm離心5sec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量吸干液體，加入20?l DEPC-H2O溶解RNA。
2.試劑配制
取n×19?l H7N9核酸熒光PCR檢測混合液與n×1?l RT-PCR酶（n為反應管數）,振蕩混勻數秒, 3000rpm離心數秒。
3.加樣取上述混合液20?l置于PCR管中，然后將樣品核酸提取液、DEPC-H2O、陽性對照品各5?l分別加入PCR管中，蓋好管蓋，立即進行PCR擴增反應。
4. PCR擴增反應管置于定量熒光PCR儀上，推薦循環參數設置：
45℃×10min; 95℃×15min;循環一次，再按95℃×15sec→60℃×60sec，循環45次;單點熒光檢測在60℃，反應體系為25?l。
熒光通道檢測選擇：選用FAM通道。
軟骨蛋白聚糖抗體

5-氨基酰酸合酶1抗體

p53凋亡刺激蛋白1抗體

P53凋亡刺激蛋白2抗體

激活素受體2B抗體

AIMP2抗體

酰膽堿酶抗體

5-氨基酰酸合酶1抗體

防御素α1/3抗體

ABC膜轉運蛋白抗體
牛型放線菌PCR檢測試劑盒說明書4000 unitsEco32I (EcoRV)4000 units

800 unitsEco47I (AvaII)800 units

4000 unitsEco47I (AvaII)4000 units

200 unitsEco47III (AfeI)200 units

1000 unitsEco47III (AfeI)1000 units

500 unitsEco52I (EagI)500 units

2500 unitsEco52I (EagI)2500 units

200 unitsEco57I (AcuI)200 units

1000 unitsEco57I (AcuI)1000 units

2000 unitsEco72I (PmlI)2000 units

500 unitsEco81I (Bsu36I)500 units
反應五要素:
牛型放線菌PCR檢測試劑盒說明書參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。