原代細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化方法

1)選用密度的健康細(xì)胞

細(xì)胞的匯合度應(yīng)為40–80%，并且傳代次數(shù)較低(比如小于50次)，即細(xì)胞不可太老。 隨著時(shí)間的推移，相對(duì)于較早傳代的細(xì)胞，培養(yǎng)原代細(xì)胞的表型和生長(zhǎng)特性通常會(huì)呈多樣變化，這也會(huì)體現(xiàn)在表達(dá)譜中。

在培養(yǎng)條件影響下(例如頻繁的溫度和pH值變化、過(guò)度培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)不足、繼代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞密度太低、胰蛋白酶連續(xù)處理、激烈吹打或離心時(shí)的剪切力以及支原體污染)，許多細(xì)胞的表達(dá)譜會(huì)發(fā)生改變。 每孔的細(xì)胞太少或太多，也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。 根據(jù)轉(zhuǎn)染容器的表面積，嘗試不同的細(xì)胞密度，比如設(shè)置低、中、高密度的孔。

2)選擇恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件

使用的組織培養(yǎng)操作方法。 siRNA遞送過(guò)程中，抗生素不是必需的，細(xì)胞吸收抗生素后可能會(huì)增加毒性。此外，一些siRNA轉(zhuǎn)染試劑要求在無(wú)血清或低血清的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染，所以一定要注意的建議。選擇恰當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基(例如某些細(xì)胞需要更多的葡萄糖或氨基酸)。

3)選用高質(zhì)量siRNA，使用Z低有效濃度

siRNA中應(yīng)不含從合成過(guò)程帶來(lái)的試劑(例如乙醇或鹽)。 長(zhǎng)于30bp的雙鏈RNA污染物可通過(guò)激活非特異性的干擾素反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而改變基因的表達(dá)。 Ambion公司標(biāo)準(zhǔn)純度的siRNA沒(méi)有此類(lèi)污染物，非常適合細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。原代細(xì)胞 在優(yōu)化遞送條件的實(shí)驗(yàn)中，確定選用的方法和細(xì)胞類(lèi)型所需siRNA的Z低有效濃度，過(guò)量使用siRNA會(huì)增加非特異性(脫靶)效應(yīng)。

4)使用siRNA陽(yáng)性和陰性對(duì)照以及未處理的樣品來(lái)監(jiān)測(cè)每次實(shí)驗(yàn)的siRNA遞送

每次實(shí)驗(yàn)必須包含siRNA陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以便監(jiān)測(cè)siRNA的遞送效率(即比較siRNA陽(yáng)性對(duì)照處理的和siRNA陰性對(duì)照處理的細(xì)胞靶標(biāo)基因的表達(dá)水平)。 在多數(shù)經(jīng)驗(yàn)證的siRNA調(diào)控和細(xì)胞體系中，可看到mRNA調(diào)控靶標(biāo)抑制效率高于≥70%。 此外，應(yīng)通過(guò)比較siRNA陰性對(duì)照和未處理的樣品中培養(yǎng)的細(xì)胞活性來(lái)監(jiān)測(cè)siRNA遞送過(guò)程的細(xì)胞毒性。

5)優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑選擇和劑量

不同細(xì)胞系和細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)染難度差別很大。 RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑能夠有效地將小RNA遞送到各種細(xì)胞中，而且細(xì)胞毒性非常小。

對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(如懸浮細(xì)胞、血液細(xì)胞、原代細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞)，某公司的科學(xué)家們建議在不同的濃度下至少?lài)L試2種不同的轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染試劑劑量不足會(huì)影響siRNA遞送和基因沉默效果，過(guò)多則會(huì)有細(xì)胞毒性。根據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型，需要不同數(shù)量的轉(zhuǎn)染試劑。

如果轉(zhuǎn)染結(jié)果不成功(基因抑制和/或細(xì)胞活性差)，可考慮采用電轉(zhuǎn)化方法或病毒載體來(lái)遞送siRNA。

6)優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物接觸時(shí)間：siRNA Complexes

轉(zhuǎn)染效率受轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的劑量影響。如果細(xì)胞毒性和靶基因抑制效率都很高，轉(zhuǎn)染8–24小時(shí)后，可利用正常培養(yǎng)基更換含有轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的培養(yǎng)基，從而降低細(xì)胞毒性并保持高的基因沉默效應(yīng)。

7)如有可能，監(jiān)測(cè)mRNA和蛋白的抑制

測(cè)量mRNA抑制效果，是監(jiān)測(cè)siRNA處理效果的Z直接的方法。通常在轉(zhuǎn)染24 - 48小時(shí)后，對(duì)靶mRNA水平進(jìn)行定量。 某些情況下，也需要測(cè)量蛋白的抑制效果，從而了解siRNA處理產(chǎn)生的生物效應(yīng)——在siRNA遞送48–72小時(shí)后測(cè)量。 蛋白表達(dá)減少問(wèn)題受mRNA和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率的影響;原代細(xì)胞對(duì)于不同的靶標(biāo)基因，觀察蛋白Z大抑制效果的時(shí)間存在差異。