原代細胞傳代培養(yǎng)法操作注意事項

原理

原代細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時

也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代(再培養(yǎng))。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。

材料和試劑

1. 細胞：貼壁細胞株

2. 試劑：0.25%胰酶、1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清)

3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等

原代細胞操作步驟

1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。

3. 置溫箱中2~5分鐘，當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。

4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。

5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。

原代細胞無菌操作注意事項

1. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

3. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

5. 瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。

6. 吸溶液的吸管等不能混用。