原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)（*天） 
   1) 顯微鏡觀察母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，確定傳代比例。 
為了獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，必需保證細(xì)胞處于合適的生長(zhǎng)密度，因此應(yīng)根據(jù)母細(xì)胞的生長(zhǎng)密度調(diào)整傳代比例。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的合適細(xì)胞密度為50％－70%，本實(shí)驗(yàn)中使用的293細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后一般按照1：6傳代即可。 
   2) 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋，倒去皿中的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，加入2mlHank’s液，輕輕搖動(dòng)，將溶液倒出。 
   3) 消化與分裝。 
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細(xì)胞變圓且彼此分離表明消化*，此時(shí)可加入10ml營(yíng)養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，使培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞全部脫落下來(lái)，并分散形成均勻的細(xì)胞懸液。按照傳代的比例補(bǔ)加適當(dāng)體積的營(yíng)養(yǎng)液，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中。 
在分裝好的細(xì)胞培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 
2. 用磷酸鈣介導(dǎo)的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293細(xì)胞中過量表達(dá)TNF－R1（第二天） 
   1) 顯微鏡觀察待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài) 
      a. 觀察細(xì)胞是否污染 
      b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化 
      c. 觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度 
   2) 轉(zhuǎn)染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質(zhì)粒DNA（實(shí)驗(yàn)組為TNF-R1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，對(duì)照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混勻。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。 
      c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕晃動(dòng)使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中。 
3. 凋亡細(xì)胞的形態(tài)觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天） 
   1) 顯微鏡觀察過量表達(dá)TNF-R1（實(shí)驗(yàn)組）和空載體（對(duì)照組）的293細(xì)胞形態(tài)上的差異。 
   2) 用10ml玻璃吸管將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重懸細(xì)胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，原代細(xì)胞加入RNaseA(10mg/ml)，37°C靜置20分鐘。 
   3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。
小鼠核因子κB亞基p65親和肽(NF-κB p65)     白介素31受體aIgG    腸道菌
小鼠黑色素(MC Ab)     白介素2受體γ鏈IgG    大腸桿菌
小鼠橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白α (sm Actinin-α)     白介素2IgG    大腸菌群
小鼠紅生成素(EPO)     白介素26IgG    大腸菌群
小鼠環(huán)孢素A(CsA)     白介素-22受體IgG    大腸菌群
小鼠環(huán)孢素A(CsA)     白介素22受體結(jié)合蛋白IgG    腸道菌
小鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)     白介素-22IgG    大腸桿菌
小鼠黃體生成素釋放激素(LHRH)     白介素21受體IgG    大腸菌群
小鼠活化蛋白C(APC)      白介素21IgG    大腸菌群 糞大腸菌群 大腸桿菌
小鼠活化素A(ACV-A)     白介素20受體β鏈IgG    大腸菌群 大腸桿菌
原代細(xì)胞