【產品用途】

　　玉米赤霉烯酮(ZEN)免疫親和柱適合于和HPLC、LC-MS及ZEN酶免分析試劑盒結合使用，定量檢測ZEN。適用于糧食及糧食制品、食品、飼料等樣本中的ZEN凈化處理，提高了樣品的純度，純化后的提取液可用不同的分析方法測定。

　　【測定原理】

　　玉米赤霉烯酮免疫親和柱測定的基礎是抗原抗體反應，抗玉米赤霉烯酮(ZEN)的單克隆抗體連接在柱內凝膠介質上，樣品中的ZEN經過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢通過ZEN免疫親和柱，在免疫親和柱內，ZEN與抗體結合，洗滌液通過免疫親和柱除去未被結合的雜質。采用甲醇洗脫ZEN，然后進行相關分析。

　　【所需材料】(不提供)

　　(1)設備及器皿耗材：天平、粉碎機、離心機、渦旋混勻儀或搖床(轉速≥200r/min);量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器(100μL~1000μL)、快速定性濾紙、玻璃微纖維濾紙(whatman934-AH，直徑11cm，孔徑1.5μm)、20mL玻璃注射器等。

　　(2)試劑：甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)、lv化鈉、蒸餾水或去離子水。

　　【試劑配制】

　　0.1%吐溫20-PBS溶液：將0.1%吐溫20-PBS粉末(廠家提供)直接用900mL水全部溶解后，用HCl或NaOH調pH至7.4，用水定容至1L。

　　5M NaOH溶液：稱取20gNaOH，溶于100mL水中。

　　【樣品制備及凈化】

　　(1)糧食及糧食制品

　　----準確稱取40g(精確至0.01g)粉碎的樣品，加入4glv化鈉;

　　----與100mL乙腈-水溶液(9+1，v/v)混合，搖床振蕩提取15min;

　　----用快速定性濾紙過濾或4000r/min，離心5min;

　　----準確移取10mL濾液或上清液，加入40mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用;

　　----準確移取10mL混勻濾液(相當于0.8g樣品)過親和柱。

　　(2)醬油、醋、醬及醬制品

　　----準確稱取25g(精確至0.01g)樣品到100mL容量瓶中;

　　----加入純乙腈定容至100mL，搖床振蕩提取15min;

　　----用快速定性濾紙過濾或4000r/min，離心5min;

　　----準確移取10mL濾液或上清液，加入40mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用;

　　----準確移取10mL混勻濾液(相當于0.5g樣品)過親和柱。

　　(3)酒類

　　----準確稱取脫氣酒類試樣(含二氧化碳的酒類使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，過濾或超聲脫氣)或其他不含二氧化碳的酒類試樣20g(精確至0.01g)樣品于50mL容量瓶中;

　　----加入純乙腈定容至50 mL，搖床振蕩提取15min;

　　----用快速定性濾紙過濾或4000r/min，離心5min;

　　----準確移取10mL濾液或上清液，加入40mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用;

　　----準確移取10mL混勻濾液(相當于0.8g樣品)過親和柱。

　　(4)大豆、油菜籽及植物油

　　----準確稱取40g(精確至0.01g)樣品，加入4glv化鈉;

　　----加入100mL乙腈-水(9+1，v/v)，搖床振蕩提取15min;

　　----用快速定性濾紙過濾或4000r/min，離心5min;

　　----準確移取10mL濾液或上清液，加入40mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用;

　　----準確移取10mL混合濾液(相當于0.8g樣品)過親和柱。

　　(5)飼料原料及成品料等

　　----準確稱取20g(精確至0.01g)粉碎的樣品，加入4glv化鈉;

　　----加入100mL甲醇-水溶液(8+2，v/v)，搖床振蕩提取15min;

　　----用快速定性濾紙過濾4000r/min，離心5min，對于pH低于6.0的玉米加工副產物及飼料等的濾液或上清液，需要用 5M NaOH調pH至7.0左右;

　　----準確移取10mL濾液或上清液，加入30mL 0.1%吐溫20-PBS稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用;

　　----準確移取5mL混勻濾液(相當于0.25g樣品)過親和柱。

　　【親和柱凈化】

　　注意：整個純化過程盡量不要讓柱子干燥!

　　----3mL柱管取出上方堵頭，減去上堵頭螺紋下突出部分，插回柱子上，另一端與20mL針筒固定后使用;將1mL柱管上方堵頭取出后斜剪斷，然后再插回柱子上(柱管內偶見有小氣泡屬正常現象，不影響親和柱的使用);

　　----準確移取上述混合濾液，注入針筒中，調節針筒壓力使其以2秒/滴的速度緩慢通過免疫親和柱;

　　----用20mL水沖洗柱子(對于醬油、醋、油類以及飼料等顏色較深的樣液，先用10mL 0.1%吐溫20-PBS清洗，再用10 mL 10%甲醇-水沖洗柱子，用10mL水沖洗柱子。)，流速1秒/滴，棄去流出液，直至2~3mL空氣通過柱體，保證柱子內沒有殘余液體;

　　----準確加入2.0mL甲醇(色譜級)洗脫，流速自然重力，直至2~3mL空氣通過柱體，保證柱子內沒有殘余液體。收集全部洗脫液，進行相關測定。

　　【檢測方法】

　　IAC-HPLC法檢測

　　----過有機濾膜(孔徑0.22μm)后，直接HPLC測定;或在50℃下用氮氣緩緩地吹至近干，加入流動相混勻，過有機濾膜(孔徑0.22μm)后，參照GB 5009.209-2016或GB/T 28716-2012條件進行HPLC測定。

　　【注意事項】

　　(1)玉米赤霉烯酮對人體有害，應戴手套操作。凡接觸到標樣的玻璃器皿都要用5%次lv酸鈉浸泡過夜。

　　(2)不要使用過有效期的免疫親和柱。

　　(3)免疫親和柱應在2~8℃保存。不要冷凍。

　　(4)使用前，免疫親和柱需至少提前半小時回溫至室溫(25℃左右)。

　　(5)HPLC測定值、試劑盒測定值接近zui高檢出值時，樣本的實際含量可能大于柱容量而造成流穿，建議減少上樣體積或者將樣品提取液用20%甲醇-水稀釋后再上樣。

　　(6)稱取的樣品量以及提取液的體積可根據實際情況按比例調整，建議不少于10g樣。

　　(7)玉米赤霉烯酮對光線敏感，因此樣品及其提取液應當低溫(2~8℃)、避光保存。