如何設(shè)定抗體實(shí)驗(yàn)中各種樣品選擇的條件：
一、如何選擇合適的一抗
請(qǐng)先確定您要檢測(cè)的種屬和使用的實(shí)驗(yàn)方法，然后查找相關(guān)產(chǎn)品，根據(jù)說明書上描述的“適用種屬和實(shí)驗(yàn)方法”來確定合適的抗體。如果說明書中有明確您要檢測(cè)的種屬和實(shí)驗(yàn)方法均經(jīng)過檢測(cè)，則您可以放心地購買該產(chǎn)品。
二、如何選擇合適的二抗
二抗的選擇原則：
針對(duì)一抗Ig亞型的(比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗體)
針對(duì)一抗來源的二抗(比如一抗是小鼠來源的，二抗就要是抗小鼠的)
為了增加特異性、降低背景：可以選擇Fab段的抗體(去除Fc段的)、經(jīng)過標(biāo)本來源種屬血清吸附的的二抗
查看二抗的說明書，選擇經(jīng)過驗(yàn)證可以用于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法的二抗
三、如何確定一抗的稀釋比例
如果說明書中有推薦的稀釋比例，請(qǐng)按照該稀釋比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是由于標(biāo)本類型、實(shí)驗(yàn)條件、操作環(huán)境等各種因素的影響，推薦濃度僅作為參考。實(shí)驗(yàn)者需要在推薦濃度周圍進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)，從中發(fā)現(xiàn)的稀釋比例。
如果說明書沒有推薦稀釋比例，僅注明“Useatanassaydependentdilution”，就需要做大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)來摸索的比例了。 下表列出的純化抗體抗體用于不同實(shí)驗(yàn)方法時(shí)常用的工作濃度，可以作為預(yù)實(shí)驗(yàn)的參考。未純化的抗體一般在說明書中不會(huì)標(biāo)明抗體的濃度，因?yàn)榇蟛糠秩寡濉?培養(yǎng)上清或腹水形式的產(chǎn)品濃度都是沒有經(jīng)過測(cè)定的。如果未純化抗體產(chǎn)品的說明書中沒有標(biāo)明其中特異性抗體的濃度，實(shí)驗(yàn)者可以參考下表中“估計(jì)濃度”確定各 種實(shí)驗(yàn)稀釋比例。
四、如何選擇同型對(duì)照
同型對(duì)照的主要目的是確定一抗的結(jié)合是特異性的，而不是非特異性的Fc受體或與其他蛋白的相互作用。同型對(duì)照要與一抗的來源、Ig分型和標(biāo)記*一 致。例如：一抗是FITC標(biāo)記，其抗體分型是小鼠的IgG1，則同型對(duì)照要選擇是FITC標(biāo)記的小鼠的IgG1。這里如同使用流式抗體一樣，同樣的不可離 開說明書！
多抗的同型對(duì)照：
絕大部分的同型對(duì)照產(chǎn)品都是單克隆抗體，因此不適用于作為多克隆抗體的對(duì)照(因?yàn)槎嗫购卸喾NIgG的亞型)。
五、如何選擇陽性對(duì)照
陽性對(duì)照的使用是一個(gè)實(shí)驗(yàn)中確定抗體及檢測(cè)系統(tǒng)是否正常工作的依據(jù)，也是確定待測(cè)標(biāo)本中是否存在待測(cè)蛋白的一個(gè)依據(jù)！尤其是檢測(cè)的標(biāo)本是不確定是否有待測(cè)蛋白表達(dá)時(shí)。因此當(dāng)實(shí)驗(yàn)沒有陽性結(jié)果出現(xiàn)時(shí)，的選擇是實(shí)驗(yàn)合適的陽性對(duì)照。
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