前言
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質譜儀器作為一種質量檢測儀器，被應用到各個學科領域中，尤其是在化學化工、環(huán)境能源、醫(yī)藥、生命及材料科學等領域發(fā)揮著重要作用。在常規(guī)質譜分析中，被分析物質首先被離子化，隨后各種離子被引入真空中的質量分析器，在分析器中的電場或磁場作用下，離子的運動特性隨其質荷比不同而產生差異，因而造成時空上的分離，并由檢測器依次檢測出來。而在這種原理下，質譜儀測量的是離子的質荷比（m/z)，而不是質量本身。
Challenge
現有質譜儀在超大分子量檢測中
面臨的挑戰(zhàn)
利用質譜儀器對樣品的分析過程中，樣品的霧化過程十分關鍵。目前，常用的電噴霧技術原理是由John Fenn提出的電噴霧電離（ESI）技術，這一理論也獲得了2002年的諾貝爾化學獎。通常對蛋白質這種大分子來說，ESI質譜中都會呈現多種價態(tài)的譜峰群，群落中的每一組為某個電荷態(tài)該蛋白質的各個同位素峰、鹽峰以及加合物峰等。由于電荷態(tài)z通常是連續(xù)的整數分布（例如z = 11，12....21,22...)，人們可以通過計算不同電荷數對應的群落m/z的間隔來推算各組的電荷數z，進而求出實際的質量m的分布，也可以使用軟件進行解卷積得到m分布。這種分析手段對于分析分子量較小（分子量在5萬以下）、簡單純凈的蛋白樣品還是很有效的。
然而，在實際應用中對天然蛋白和病毒顆粒的分析卻不那么簡單。隨著分子量上升，分子結構越來越復雜，各種翻譯后修飾使被測蛋白的分子量出現差異化，很寬的質量分布（可達上千Da）使得不同價態(tài)的峰群連接在一起。如圖1所示，這種缺少電荷狀態(tài)以及同位素峰的“死亡駝峰”，我們很難通過解卷積的形式進行分析。
△圖1：死亡駝峰示意圖（點擊查看大圖）
并且，對于很多糖蛋白，分子量超過3、4萬就出現峰群交疊，無法用解卷積軟件來獲得分子量的分布信息。因此，對于大生物分子的質譜分析，僅靠提高儀器的分辨率是無濟于事的。在這種情況下，電荷檢測質譜（CDMS）技術便成為了我們的“救命稻草”。
Q Exactive UHMR 高分辨質譜儀
直接分析質譜技術DMT
電荷檢測質譜（CDMS）通過同時測量單個離子的質荷比和電荷數，進而計算獲得離子質量m。
因此，相較于其他類型質譜，CDMS技術的關鍵是如何準確地測量單個離子的電荷。目前，電荷檢測質譜技術還沒有現成的商品化儀器，只有能夠自己開發(fā)質譜儀器硬件，或自己改編FTMS軟件的專家才能進行這樣的實驗。而在今年的ASMS會議上，賽默飛公司重磅推出了直接分析質譜技術（DMT），并將其結合在了Orbitrap上，這使得超大分子量的復雜蛋白的直接質譜檢測成為了可能。
直接分析質譜技術
直接分析質譜技術其原理是：在Orbitrap中檢測來自離子沿中心電極的中心軸旋轉的軸向頻率，進而確定離子的m/z信息；與此同時，來自外電極上的感應電荷振幅也會被檢測，從而確定離子的電荷z的信息。
△圖2：DMT技術原理圖
（點擊查看大圖）
直接分析質譜技術模式為 Orbitrap 質量分析儀增加了電荷檢測功能，能夠同時測量數百個單個離子的質荷比 (m/z) 和電荷數 (z)。這使得 Orbitrap 質量分析儀可以直接計算分析物的質量，而不需要根據 m/z 去卷積。根據 m/z 去卷積的方法依賴于測量結果中已分辨的電荷狀態(tài)和/或同位素分辨的信號。直接分析質譜技術模式提高了分辨率，并且擴展了動態(tài)范圍，提高了可獲得的質量測量結果的上限，同時由于單個離子測量的靈敏度較高，可以從濃度明顯較低的樣品中采集到更有價值的數據。
Q Exactive UHMR
（超高質量數范圍）質譜儀
作為第一個商業(yè)化的電荷檢測質譜儀，Q Exactive UHMR質譜儀不僅配備了直接分析質譜技術模式，而且還擁有適合大蛋白分析的性能參數（圖3），例如掃描范圍350-80000，四極桿隔離高達 m/z 25,000，還同時具備源內捕獲, Source CID, HCD 等多種碎裂模式。
△圖3：Q Exactive UHMR質譜儀
（點擊查看大圖）
基于此，我們提供了端到端的工作流程（圖4），適用于數據采集、處理和解讀以前難以分析的靶點。這大大降低了我們在實際使用過程中的難度。
△圖4：Q Exactive UHMR質譜儀配備直接分析質譜技術的端到端工作流程
（點擊查看大圖）
Q Exactive UHMR
質譜儀應用實例
01
穩(wěn)健地表征復雜的異質非變性蛋白質
高異質性蛋白質復合體的非變性質譜表征對于理解生物進程和開發(fā)下一代生物治療藥物至關重要。將傳統(tǒng)的非變性質譜技術與僅測量 m/z 的集成測量結合使用時，由殘余溶劑、離子加合物和翻譯后修飾引起的電荷態(tài)分布的重疊某種程度上提高了復雜性，往往使得譜圖難以解卷積。
直接分析質譜技術模式克服了這些挑戰(zhàn)，能夠對膜蛋白質、大型非共價蛋白質復合體、糖蛋白以及高度異質性的基于蛋白質和非蛋白質的治療藥物進行詳細表征，并且提高了分辨率、靈敏度和動態(tài)范圍。
如糖蛋白，它在許多生理機能和某些疾病的進展中發(fā)揮了關鍵作用。由于存在異質性，使用傳統(tǒng)的、完整的、自上而下的質譜方法進行糖蛋白表征，這對研究人員來說是極其復雜的質譜挑戰(zhàn)。此外，非變性質譜的糖型檢測也受到空間分辨率和動態(tài)范圍的限制。而直接分析質譜技術模式通過提高分辨率、拓展動態(tài)范圍，開啟了多種全新的可能，能夠準確、高效、詳細地鑒定各種糖型。
下圖5所示就是對人胎球蛋白 A上的糖基化鑒定。由于人胎球蛋白 A有兩個 N- 糖基化位點；最多七個 O- 糖基化位點；七個磷酸化位點；六個二硫鍵以及多種序列變體，使得直接質譜分析十分困難。而使用具備直接分析質譜技術模式的 Q Exactive UHMR質譜儀，則可以獲得完整胎球蛋白 A 的更全面的糖型譜圖（圖5）。
△圖5：胎球蛋白 A 的在兩種質譜模式下的綜合表征（點擊查看大圖）
02
以超高的靈敏度篩查和表征膜蛋白質
膜蛋白質及其復合體負責不同的生物機能，因此是特別常見的藥物靶點，但由于其樣品制備要求較高，其分析可能會充滿挑戰(zhàn)。通過并行單個離子測量，直接分析質譜技術模式提供了更高的靈敏度和分辨率，可以將樣品稀釋數百倍，以便使用微量的珍貴樣品，單次運行即可實現樣品表征。現在有可能qian suo未有的靈敏度對非變性膜蛋白質進行篩選、雜質鑒定和同位素分辨表征，包括蛋白質變體和配體結合。
△圖6：DMT模式鑒定大腸桿菌水通道蛋白Aquaporin Z（AqpZ）（點擊查看大圖）
大腸桿菌水通道蛋白 Aquaporin Z（AqpZ） 是一個約為 99 kDa 的膜蛋白，由四個亞基組成。使用具備直接分析質譜技術模式的 Q Exactive UHMR質譜儀對 AqpZ 進行非變性質譜分析，在高能源內捕獲設置下注入單體，揭示了 AqpZ 在單體和四聚體形式中的兩種主要分布情況（上圖）。將此譜圖轉換為質量域，這也顯示了樣品的雜質（中間）。用低分辨率進一步分析四聚體的峰值，結果表明出現了 28 Da變化的修飾（左下），或者高分辨率可以對質量域中的四聚體復合體蛋白變體進行同位素解析（右下）。
03
復雜性蛋白質形態(tài)的表征
對于復雜生物治療藥物的分子，傳統(tǒng)方法下我們無法對復雜的生物治療藥物進行全面的表征分析，或只能進行非常困難的流程。而依賴于直接分析質譜技術模式的 Q Exactive UHMR質譜儀，我們能夠獲得更寬的動態(tài)范圍和更高的分辨率，并且做到同時測量m/z 和 z，因此可以觀察到更多的蛋白質形式。
△圖7：依那西普結構圖與質譜表征
（點擊查看大圖）
依那西普/Etanercept是一種 Fc 融合蛋白（圖7，左圖），代表了一類新的治療性生物藥物。依那西普是一種腫瘤壞死因子（TNF）抑制劑，可阻斷導致類風濕性關節(jié)炎和其他自身免疫性疾病的炎癥和關節(jié)損傷的細胞因子瀑布級聯。表征復雜的生物治療藥物面臨著很多的分析挑戰(zhàn)，可能需要進行復雜的樣品處理和多個質譜實驗。與傳統(tǒng)的集成質譜方法相比，直接分析質譜技術模式通過直接測定電荷狀態(tài)和質量，使復雜的生物治療藥物的表征越來越可靠，從而使得質量分布可視化的范圍更為廣泛，并且通過提高分辨率讓這個蛋白的更多類型被呈現。（圖7右圖）
配備直接分析質譜技術的
Q Exactive UHMR質譜儀
應用范圍
配備直接分析質譜技術的Q Exactive UHMR質譜儀在天然蛋白質、糖蛋白、病毒顆粒的成分和結構研究，抗原-抗體作用機理研究和疫苗研發(fā)方面有很大的未來市場空間：
△圖8：Exactive UHMR質譜儀應用范圍
★1）實現復雜樣品的精確分析，同時提供復雜樣品中各蛋白分子的m/z與z等信息。
★2）測定糖蛋白及其它翻譯后修飾造成的特定質量分布圖，解釋蛋白與翻譯后修飾之間的關系，從而對糖蛋白相關的疾病診斷具有重要意義。
★3） 通研究DNA等生物大分子離子的電荷分布，以及質量與電荷的關聯，推斷這些大分子的結構，比如它的聚合程度等。
★4）在病毒研究中，可以用來確定病毒衣殼的蛋白復合體結構及其組裝反應的過程
★5）在基因療法研究和產品質控中，可以用來測定腺病毒載體的空殼率，檢查載體內的基因完整度。
★6）滅活疫苗、病毒載體疫苗以及核酸疫苗產品的質量控制、效果評價
直接分析質譜技術
在結構生物學和生物制藥
應用中的優(yōu)勢
★1）準確的直接質量測定，不需要根據 m/z 去卷積
★2）相對于傳統(tǒng)的集成離子測量，分辨率最高可提高 20 倍
★3）僅需要較少的樣品或濃度較低的樣品
★4）可獲得高達 80,000 m/z 的測量值和兆道爾頓 (MDa) 的質量測量值
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