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分析方法在其生命周期中會需要變更或調(diào)整以滿足性能指標(biāo)的要求，當(dāng)在不同的實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移（確認(rèn)的）方法時，如從研發(fā)實(shí)驗(yàn)室到QC實(shí)驗(yàn)室，或類似CRO、CMO/CDMO實(shí)驗(yàn)室，或者各種生物技術(shù)創(chuàng)新平臺，需要考慮(U)HPLC儀器參數(shù)對色譜分離的影響，尤其面臨儀器參數(shù)偏差，以及某些方法對偏差做出的響應(yīng)時，確保液相方法在各原實(shí)驗(yàn)室和方法接收方的成功轉(zhuǎn)移。針對補(bǔ)償梯度延遲體積的差異，基于軟件的GDV差異補(bǔ)償，通常是通過進(jìn)樣事件的時間位移或梯度曲線變化的方法改變，這可能會引起監(jiān)管機(jī)構(gòu)的擔(dān)憂。管制機(jī)構(gòu)通常允許改變等度保持時間，只為模擬體積差異。基于硬件的解決方案是使用硬件來模擬GDV和混合行為， 而混合器和樣品環(huán)的手動改變可能需要系統(tǒng)再確認(rèn)。最為可選是LC系統(tǒng)具備連續(xù)可調(diào)GDV，有利于追蹤，不需要再確認(rèn)。

方法轉(zhuǎn)移并不像看上去那么簡單，需要考慮至關(guān)重要的儀器細(xì)節(jié)，主要因素有梯度延遲體積GDV、擴(kuò)散效應(yīng)、溫控模式，以及不那么明顯的檢測器設(shè)置。

從下圖可見儀器參數(shù)及其對成功的 (U)HPLC方法轉(zhuǎn)移的重要性，離圖形中心越遠(yuǎn)，參數(shù)越重要。重要性值是估計值，取決于分離溫度，流速等方法的詳細(xì)信息。

梯度延遲體積(GDV)影響梯度方法的保留時間和分離度，需要注意混合體積收縮效應(yīng)和泵的混合模式不同引起的流速和梯度非線性，不同配置儀器上梯度延遲體積GDV也非恒定不變，對流速和壓力的依賴性各不相同。

流動相混合體積效應(yīng)：收縮體積依賴于溶劑和混合比例，LPG泵頭對GDV有貢獻(xiàn)

不同類型HPLC儀器上梯度延遲體積GDV 對流速和壓力的依賴性見下圖。

HPG和HPG之間的方法轉(zhuǎn)移匹配 GDV 非常簡單，LPG 與 LPG之間的方法轉(zhuǎn)移更有挑戰(zhàn)性（混合特性也必須匹配），最好避免LPG和HPG之間的轉(zhuǎn)移。

更換混合器是物理改變系統(tǒng)GDV的有效方法。缺點(diǎn)是它只允許根據(jù)可用的混合器體積逐步改變GDV，是一種粗調(diào)GDV方式。

Vanquish 液相色譜系統(tǒng)自動進(jìn)樣器計量泵的可設(shè)定閑置體積允許精細(xì)調(diào)節(jié)系統(tǒng)GDV：

1

改變泵梯度混合器，以實(shí)現(xiàn) GDV逐步變化

2

滿足高要求難分離時無縫調(diào)節(jié)的需要

3

不需要手動改變硬件設(shè)置

4

審計追蹤和設(shè)備驗(yàn)證wan全合規(guī)

Vanquish液相色譜系統(tǒng)在自動進(jìn)樣器中使用計量泵在進(jìn)樣前吸取樣品。計量泵是流路的一部分，對系統(tǒng)的GDV有貢獻(xiàn)。計量泵的沖洗體積可以通過柱塞的運(yùn)動而改變， 這一沖洗的體積就是閑置體積，閑置體積的改變有助于GDV的無縫調(diào)節(jié)。計量泵柱塞位置對梯度延遲體積的影響。結(jié)構(gòu)設(shè)計旨在確保獨(dú)立于活塞位置，整個閑置腔體被沖洗，結(jié)構(gòu)設(shè)計可防止在所有柱塞位置（閑置體積）和流速中出現(xiàn)停滯區(qū)。可以通過軟件命令減少到較小體積來模擬具有較小 GDV 的系統(tǒng)（圖 1，左圖）或增加到更大的體積以模擬具有較高 GDV 的系統(tǒng)。設(shè)定的閑置體積和進(jìn)樣體積是相互獨(dú)立的，即兩者的任意組合是可能的。閑置體積的設(shè)置由賽默飛世爾科技變色龍色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng) （CDS） 軟件審核追蹤 ，因此wan全可審核。

為了進(jìn)一步擴(kuò)展 GDV 的靈活性，一個方法轉(zhuǎn)移套件 （P/N 6036.2100） 可用于 Vanquish HPLC 系統(tǒng)。它由一個 2 位 6 通切換閥和一個可接入流路的 200 μL 定量管組成，是可切換的附加梯度延遲體積。

在上圖旁路位置，來自泵的連接管線直接與進(jìn)樣器聯(lián)通，類似于儀器沒有安裝方法轉(zhuǎn)移套件。當(dāng)切換閥時，定量管變成流路的一部分，管線的體積添加到系統(tǒng)的整體梯度延遲體積中（上圖下）。

摩擦熱下的UHPLC 強(qiáng)制空氣循環(huán)與靜止空氣柱溫控模式比較如下：

避免由預(yù)熱和柱溫控模式引起的熱不匹配造成的分離度的損失。

柱外體積ECV包括柱前和柱后體積，后者主要來自流通池體積，其影響大小取決于色譜柱的尺寸，Viper零死體積接頭有助于減小ECV。

樣品溶劑不匹配會造成峰變形和分離度損失：

當(dāng)樣品溶劑（100%甲醇）強(qiáng)度高于洗脫液（50：50水/乙腈）時需要減少進(jìn)樣體積。使用UDP用戶自定義進(jìn)樣程序功能可實(shí)現(xiàn)緩解溶劑效應(yīng)，大體積進(jìn)樣、在線衍生等功能，幫助用戶對設(shè)備實(shí)施精準(zhǔn)操控，更能令方法轉(zhuǎn)移后的譜圖質(zhì)量超越原譜圖質(zhì)量。

使用1 mm 內(nèi)徑色譜柱等度分離標(biāo)準(zhǔn)品化合物，使用高靈敏度的60 mm 流通池 (藍(lán)色標(biāo)記) 和低擴(kuò)散流通池 (紅色標(biāo)記)，可見使用大體積流通池時分析物峰擴(kuò)展和分離度損失。當(dāng)色譜柱尺寸保持不變時，適用流通池體積選擇為10%峰體積這一原則。