產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（大腸埃希氏菌）探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

1、 試劑盒簡介貨為了適應(yīng)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（大腸埃希氏菌）探針法快速檢測和疫病研究的需要，本公司參照 OIE 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的引物序列，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。2、試劑盒組成:

試劑盒組成包括*和核酸擴(kuò)增試劑，具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。

3、樣本采集，存放及運(yùn)輸

3.1 樣本采集

所用取樣器材必須經(jīng)過高壓滅菌并烘干。取對蝦的腮絲、肝胰腺、腹肢等組織各30mg標(biāo)記后置于離心管中，按照試劑盒配套的DNA抽提試劑盒操作說明提取DNA模板。

3.2 存放

研磨后的樣本應(yīng)盡快提取 DNA；待測樣本應(yīng)避免凍融。

3.3 運(yùn)輸

采用或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

4、檢測步驟

4.1.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)：

取 n 個(gè) 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個(gè)管進(jìn)行編號標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用一個(gè)吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。

4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃ 條件下，2 000 r/min 離心 10 s。

4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清， 即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。

4.1 PCR 檢測

4.1.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制見下表 2。

表 2 每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制表

4.1.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

向每個(gè) PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL，蓋緊管蓋，500

r/min 離心 30 s。

4.1.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）： 階段，95 ℃/3 min；

第二階段，94 ℃/30 sec，60 ℃/30sec；72℃/1 min；35個(gè)循環(huán)；

第三階段，72 ℃/7 min； 第四階段，4 ℃ 保存

4.3 瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，向 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液），按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對照。5 V/cm 電泳約 0.5h，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)一定位置時(shí)停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性 DNA 電泳帶，拍攝并記錄。

5、結(jié)果判定

5.1 PCR 后，陽性對照會出現(xiàn)一條 196bp 的 DNA. 片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2 待測樣品 PCR 擴(kuò)增后能在相應(yīng) 196 bp DNA 位置上有帶，可判為 BP 核酸陽性。

6、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-GAT-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’

R: 5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’