ELISA - 方法類型和操作步驟
來源：上海基免實業(yè)有限公司
2014年01月02日 14:40
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。該法適于測定細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測到每毫升納克水平的細(xì)胞因子（或受體）的水平。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。
根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。
（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，
（二）雙位點一步法在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
（三）間接法測抗體間接法是檢測抗體zui常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。
（四）競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。
（五）捕獲法測IgM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。
（六）應(yīng)用親和素和*的ELISA親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個*分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。*（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，*－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成*化的產(chǎn)物。親和素與*的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個*分子的結(jié)合位置，可以連接更多的*化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和*與ELIS偶聯(lián)起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－*系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在固相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與*結(jié)合，通過親和素－*反應(yīng)而使*化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用*化的抗體替代，然后連接親和素－酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中， 通常標(biāo)準(zhǔn)配體是固定的， 通過加入溶液相受體或蛋白質(zhì)來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應(yīng)的抗體來定量成鍵的受體， 而且zui初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端， 在其末端的堿性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發(fā)生反應(yīng)， 從而使溶液顯色.
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