傳統熒光顯微鏡使用熒光物質標志細胞中的特定結構，不僅圖像與背景的對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辨率。但當所觀察的熒光標本稍厚時，傳統熒光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現出來：焦平面以外的熒光使得圖片模糊、發虛，對比度降低。

圖1. 共聚焦光路

 
       激光共聚焦顯微鏡恰恰是為解決這個問題應運而生，科學家在光路中放置一個Pinhole，利用這個Pinhole阻擋焦平面以外的熒光（如圖1），提高對比度！由于對比度的大大提升，使得通過共聚焦顯微鏡得到的圖像細節更加清晰，因此受到了各個領域研究者的廣泛青睞！
共聚焦利用Pinhole排除非焦平面光線干擾，提高圖像對比度的同時，我們往往忽略了一個問題，那就是：Pinhole實際上是削弱了熒光信號的（如圖2）！只不過共聚焦顯微鏡利用高功率的激光提供了更強能量的激發光以彌補Pinhole對熒光信號的削弱。

圖2. Pinhole對熒光信號的削弱作用

 
       對于固定細胞，高能量激發光的影響主要在對于熒光分子的光漂白作用。而對于活細胞不單單是光漂白作用會影響成像，更加嚴重的是高能激發光對于活細胞產生的光毒性可能干擾細胞的生理過程。
        zui后一點：共聚焦采用點成像的工作模式，成像速度慢，對于各種動態生理活動的觀察時間分辨率低。