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人源細胞培養(yǎng)操作規(guī)程

來源:上海莼試生物技術有限公司   2018年04月12日 14:46  

人源細胞處于未分化狀態(tài):ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2-3天從達到80%-90%融合的平板按1:8的比率傳代細胞一次,細胞傳代以后,在將細胞接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿之前,通過預先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時,使分化細胞粘附,從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃,5%CO2,100%濕度條件下培養(yǎng)。
培養(yǎng)基:ES:配制一20×不含DMEM,HS,ESGRO的溶液(該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文)。分裝在50ml FALCON管中,(稀釋為2×,每管42ml),貯存在-20℃。通過將21ml該溶液,HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基,0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。
注:一瓶DMEM是500ml。
貯存液:DMEM(高糖)、馬血清(HS)、L-*(200mM)、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M)、β-巰基乙醇(55Mm)、PEST、ESGRO。

復蘇細胞:細胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中防止結晶的形成,結晶的形成會損害細胞。然而,二甲基亞砜對細胞有毒性,快速的進行細胞復蘇是很重要的。
操作步驟:
1.從液氮中取出一管細胞;
2.將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解);
3.將細胞轉移到一15ml Falcon管中;
4.加入5ml ES培養(yǎng)基(用培養(yǎng)基沖洗凍存管);
5.離心3分鐘;
6.棄上清,用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞,至少吹打10次;
7.接種在明膠包被(見下文)的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿;
8.孵育。
凍存細胞
人源細胞凍存液:90%HS和10%二甲基亞砜
步驟:
1.1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi);
2.用細胞刀收集細胞;
3.將細胞轉入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘;
4.棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10cm的培養(yǎng)皿用2ml,15cm的培養(yǎng)皿用6-7ml。)
5.分裝于凍存管內(nèi),每管1ml;
6.置-80℃過第二天移入液氮。
"分子式: C27H30O15 
分子量:594.52 "    Oroxin B    20mg/支    木蝴蝶苷B
94079-81-9    Poliumoside    20mg/支    金石蠶苷
"分子式:C34H44O19 
分子量:756.70 "    Forsythoside B    20mg/支    連翹酯苷B
1957/10/3    Palmitic acid    20mg/支    棕櫚酸
104112-82-5    Phellodendrine chloride    10mg/支    鹽酸黃柏堿
2141/9/5    Magnoflorine iodide    10mg/支    碘化木蘭花堿
136997-64-3    (-)-Syringaresnol-4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside    10mg/支    (-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷
110703-200726    含量測定    20mg    人參皂苷Rgl
人源細胞

 

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