組份

數目

細胞

 1 T-25瓶

細胞說明書

一份

生長特性：

貼壁生長

細胞來源：

從ATCC/中科院/協和醫院等地引進

培養條件：

培養基：F12K+0.1mg/ml肝素+1%ECGS +10%FBS（推薦德國SERANA S-FBS-SA-015優等胎牛血清）

氣相：空氣95%，二氧化碳5%

溫度：37℃

培養：

• 貼壁細胞

1.用75%酒精噴灑整個瓶消毒，將其平躺置于培養箱中進行2-3小時的緩沖，.然后置于無菌操作臺，打開瓶口，將其中的培養液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養基并置于細胞培養箱中培yang，依據細胞生長狀況及培養基顏色變化對其進行換液以及傳代；

2.待細胞長滿瓶底面積80%-90%，需要對其進行傳代，次傳代比例為1:2。

3傳代步驟：將0.25%含EDTA*置于37°預熱，倒掉培養瓶中的培養基，往培養瓶中加入1mlPBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加1ml預熱好的*，置于37°孵育消化（次消化需時常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見細胞脫落為*消化時間，記錄*消化時間，以便于下次消化），消化好后加入1ml*培養基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之*脫落，然后收集細胞懸液，1200rpm離心3min，棄上清，加入*培養基重懸細胞，進行傳代。

二、懸浮細胞

1.用75%酒精噴灑整個瓶消毒，然后置于無菌操作臺，打開瓶口，輕輕吹打后，將其中的細胞懸液轉移到離心管中，然后1200rpm離心3min，去上清；

2.將離心好的細胞轉移至T-25瓶中，并加入5-6mL新鮮培養基，然后將其置于細胞培養箱中培養，依據細胞生長狀況及培養基顏色變化對其進行換液（離心后去舊液，加入新鮮培養基）；

3.顯微鏡觀察細胞數目比較多時，對其進行傳代，次傳代比例為1:2（離心后平均分成兩瓶培養）。

細胞總數：

1~3*10⁶

傳代周期：

2-3天

傳代比例：

1:2~1:4

換液頻率：

2-3天

凍存液：

90%FBS+10%DMSO

問題

原因

解決方案

細胞生長緩慢

生長培養基使用不當

按照生產商的建議，使用相應的預熱生長培養基。

生長培養基中血清質量差

使用其他批次血清。

傳代操作不當

按照生產商的建議消化時間及傳代比例進行操作。

換液過于頻繁

降低換液頻率，參考生產商推薦的換液頻率。

細胞傳代次數過多

使用傳代次數較少的健康細胞。

細胞生長超過匯合狀態

哺乳動物細胞傳代應在細胞處于對數期、未達到匯合狀態時進行，建議細胞密度達 80-90%傳代。

細胞被支原體污染

將細胞、培養基和試劑丟棄；新取一只凍存細胞，并且使用新的培養基和試劑。

細胞復蘇存活率低

細胞凍存不當

新取一只凍存細胞，并儲存在液氮中。將細胞儲存在液氮中，直至復蘇。

自行制備的凍存細胞無活性

將細胞按照生產商推薦的密度凍存。

制備凍存細胞時使用傳代次數少的細胞。

嚴格按照生產商推薦的操作程序凍存細胞。請注意本手冊推薦的冷凍程序是凍存細胞的一般流程，只能作為指導原則使用。

新取一只凍存細胞。

細胞復蘇方法不當

嚴格按照生產商推薦的操作程序復蘇細胞。請注意本手冊推薦的解凍程序是復蘇細胞的一般流程，只能作為指導原則使用。

確保冷凍細胞解凍迅速，接種前用預熱的生長培養基緩慢稀釋細胞。

復蘇培養基使用不當

使用生產商推薦的培養基。確保培養基使用前已經預熱。

細胞稀釋過度

按照生產商的建議，將解凍后的細胞高密度接種，以改善復蘇效果。

處理細胞時動作不夠輕柔

凍存和復蘇過程對大多數細胞都會造成不利影 響。不要通過渦旋振蕩或者用力敲打培養瓶的方法使細胞脫落(培養昆蟲細胞時除外)，也不要高速離心細胞。

凍存液中所用保護劑在儲存過程中未避光

如果未避光儲存，凍存保護劑會轉變為對細胞有毒性的物質；新取一只凍存保護劑，重新凍存細胞。