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       天然細胞外基質（ECM）是粘彈性的并表現出應力松弛，而用于合成3D培養所需ECMs的水凝膠通常是彈性的。美國研究人員Ovijit Chaudhuri等通過材料學方法，獨立于水凝膠的初始彈性模量、降解和細胞粘附配體密度，單獨調節了3D培養所用水凝膠的應力松弛速率。發現培養于較快松弛速率水凝膠中的細胞鋪展、增殖和間充質干細胞（MSCs）成骨分化均得到增強。其中在初始彈性模量17kPa的快速松弛水凝膠中，MSC會形成類似于骨的礦化、富含膠原蛋白1的基質。此外研究還發現應力松弛的作用由粘附配體結合、actomyosin收縮性和粘附配體的機械聚集介導。研究成果強調了應力松弛的重要性，它是細胞-胞外基質相互作用的一個關鍵特征，也是細胞培養生物材料的一個重要設計參數。文章以“Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate andactivity”為題發表于Nature Materials。

背景

       由聚乙二醇（PEG）、藻酸鹽和透明質酸等聚合物的交聯網絡構成的水凝膠，常通過共價偶聯到整合素結合配體（如RGD）用于3D細胞培養，或作為裝載細胞的生物材料埋植劑來促進組織再生。相較于膠原、纖維蛋白等，這些水凝膠可實現獨立控制理化性質（如基質彈性、配體密度、孔隙度），以及在微尺度上的均勻性，因此常作為使用shouxuan。然而除非水凝膠可隨時間降解，否則包括形狀變化、遷移和增殖在內的一些正常細胞過程，在這些水凝膠中會受到抑制。雖然不可降解水凝膠可捕捉生理性ECM的一些特征，但通常幾乎是*彈性的。相比之下重構的細胞外基質（如膠原或纖維蛋白）和各種組織（如大腦、肝臟、脂肪組織、凝固的骨髓、初期骨折血腫或再生骨的軟骨痂）都是粘彈性的，并且在施加15%的恒定應變時表現出部分應力松弛（圖1a）。細胞在2D培養中一般產3-4%的應力，在3D培養中產生20-30%的應力。此外應力松弛試驗中測得的峰值應力范圍為100-1000 Pa，*在3D培養中細胞產生的應力范圍內。已知材料的機械特性可以調節粘附細胞的行為，基質儲存（純彈性）或消散（粘彈性）細胞力的能力強烈暗示細胞與之有相互作用。有研究發現，在使用水凝膠作為細胞培養基質的情況下，改變基質粘彈性（與基質硬度無關）會對各種細胞行為產生影響。在表現出應力松弛的凝膠中，細胞隨時間施加到基質上的每一個力或應變最初都受到一定的硬度抵抗，該硬度由初始彈性模量定義，隨后隨著時間的推移阻力減小。對于由弱交聯形成的水凝膠，松弛部分源于交聯的解結合及水凝膠流動，因此細胞力可以機械地重塑基質。本文研究了水凝膠粘彈性和應力松弛對3D培養中細胞鋪展、增殖和MSC分化的影響。

結果

01-具有可調應力松弛的水凝膠

       選擇多糖藻酸鹽（alginate）進行水凝膠納米級結構調整研究，以開發一組應力松弛速率廣泛但具有相似初始彈性模量的材料。雖然改變交聯化學物質或聚合物濃度也可以改變水凝膠的應力松弛特性，但研究人員開發了一種材料學方法，可控制具有單一交聯劑類型和相同藻酸鹽濃度的水凝膠的應力松弛速率。假設通過使用不同分子量的聚合物與不同交聯密度的鈣（與藻酸鹽離子交聯）結合，由于網絡中連接性和鏈移動性的改變，可以調節所得水凝膠的應力松弛性質（圖1b）。由聚合物分子量降低引起的初始彈性模量的任何相關降低都可以通過增加交聯來補償。此外，假設短PEG spacer與藻酸鹽的共價偶聯將為藻酸鹽鏈的交聯提供空間位阻，并增強凝膠中的應力松弛（圖1b）。這兩種方法都會改變單個聚合物鏈之間的凈親和力，從而有望控制松弛行為。因此研究人員通過將藻酸鹽的分子量從280 kDa降低到35 kDa，并且進一步將5 kDa的PEG spacer偶聯到35 kDa藻酸鹽，證實應力松弛的速率顯著提高（圖1c）。具體而言，將材料的初始應力松弛至其一半的時間（τ1/2）從約1h調整至約1min，同時藻酸鹽聚合物濃度和初始凝膠彈性模量保持恒定（圖1c-e）。這些時間范圍與各種組織中測量的范圍類似（圖1a），且可與細胞行為時間相關聯。這些材料的應力松弛行為遵循雙元素Maxwell-Weichert線性粘彈性模型。測量凝膠的頻率相關流變特性，發現隨著頻率降低，剪切儲能模量的降低速率更大，應力松弛速率的增加與之相關。共聚焦熒光顯微鏡證實凝膠在微米尺度上是均勻的。另外在組織培養條件下，這些凝膠的機械性能和凝膠的干聚合物質量在至少7天內都是穩定的（圖1f，g）。因此在這個時間尺度上，基質的降解可以忽略不計。綜上所述，該方法可以單獨控制基質應力松弛的，與初始彈性模量和聚合物濃度無關，并且沒有水凝膠降解。

圖1 調整藻酸鹽水凝膠的納米級結構，以獨立于初始彈性模量和基質降解調節應力松弛特性，從而獲得粘彈性行為。（a）交聯水凝膠（聚丙烯酰胺）、膠原凝膠、骨折血腫（人）和各種組織（大鼠）的應力松弛試驗。（b）降低鈣（紅色）交聯的藻酸鹽聚合物（藍色）的分子量如何降低網絡的糾纏與連接性（橙色箭頭），以及小spacer的耦合如何提供交聯區的空間間隔。（c）不同分子量藻酸鹽或與PEG spacer偶聯的低分子量藻酸鹽組成的凝膠的應力松弛試驗。（d）c中的τ1/2。應力松弛的時間隨結構的改變而顯著降低。（e）c中凝膠的初始模量測量。彈性模量間的差異不顯著。（f）培養1天或7天后藻酸鹽水凝膠的初始彈性模量。（g）培養1天或7天后藻酸鹽水凝膠的干質量。

02-應力松弛影響細胞鋪展和增殖

       用以上研究了3D培養中基質應力松弛速率對細胞鋪展和增殖的影響。3T3成纖維細胞封裝于RGD偶聯的藻酸鹽水凝膠中，水凝膠具有不同的應力松弛速率，但初始彈性模量均約9 kPa（圖2a）。在應力松弛時間較長（τ1/2約1h）的材料中，細胞鋪展和增殖都受到抑制，且觀察到不可降解彈性水凝膠中典型的圓形細胞形態。隨著應力松弛加快，細胞鋪展和增殖都隨之增加（圖2b，c）。當RGD細胞粘附配體密度在松弛較快的凝膠中增加時，基質應力松弛對細胞鋪展和增殖的影響增強，表明應力松弛的作用是通過基于整合素的粘附介導的（圖2d）。由于初始彈性模量和藻酸鹽濃度恒定，并且RGD細胞粘附配體密度也保持恒定在0、150或1,500 μm，因此細胞鋪展和增殖的增強僅歸因于應力松弛的改變。在快速松弛水凝膠中觀察到細胞形狀的顯著變化表明，細胞對水凝膠進行了機械重塑，由于水凝膠孔為納米級且不可降解，因此細胞形狀的變化和增殖必須通過基質移動來實現。

圖2 凝膠包裹的成纖維細胞中，鋪展和增殖隨著應力松弛的加快而提高。（a）包裹在藻酸鹽凝膠中的3T3細胞。綠色為actin，藍色為細胞核。于培養7天后拍攝。（b）包含單個3T3細胞的最小邊界框的最長尺寸的量化。細胞鋪展隨應力松弛加快而顯著增加。（c）增殖細胞定量。增殖隨應力松弛加快而增加。（d）在松弛時間為70或170s的藻酸鹽凝膠中，量化包含單個3T3細胞的最小邊界框的最長尺寸，作為RGD密度的函數。細胞鋪展隨兩種凝膠中RGD濃度增加而顯著增加。

03-基質應力松弛調節MSC分化

       接下來觀察基質應力松弛對3D培養中小鼠間充質干細胞系（D1, MSC）分化的影響。已知封裝在離子交聯藻酸鹽水凝膠中的D1 MSC和原代人MSC，在1-10 kPa初始模量下主要向成脂分化，在11-30 kPa初始模量下主要向成骨分化。假設在初始彈性模量為11-30 kPa的基質中，MSC的成骨分化將隨著凝膠中松弛的加快而減少。為了測試是否是這種情況，將MSC封裝在具有不同應力松弛時間和初始彈性模量的藻酸鹽水凝膠中（圖3a、b）。當基質的初始彈性模量為約9 kPa時，MSC主要表現出成脂分化（中性脂質染色），以及非常低水平的成骨分化（ALP染色和ALP活性定量分析），所有應力松弛時間都是如此（圖3a，b），而在松弛時間約1min的快速松弛凝膠中，發現脂肪生成水平降低。相反，在約17 kPa的較高初始彈性模量時，沒有觀察到成脂分化，并且在應力松弛較快的凝膠中成骨分化顯著增強（圖3a，b）。似乎細胞只是簡單地隨著時間的推移整合基質的彈性模量，隨著應力松弛更快，成骨減少，成脂增加。更快的應力松弛也促進了MSC更大程度的鋪展。盡管細胞初始接種密度保持不變，但7天后較硬凝膠中的細胞密度似乎更高，這可能是由于成脂細胞和成骨分化細胞之間的增殖差異。此外在彈性模量9 kPa（成脂）和17 kPa（成骨）的緩慢松弛凝膠（如τ1/2為2,300s）中，MSC間的細胞形態相似；在應力松弛時間2,300s和300s，17 kPa水凝膠中（成骨顯著增加），MSC的細胞形態也相似（圖3）。因此MSC的命運與細胞的形狀是分離的，這與以前關于MSC在3D培養中分化的發現一致。

       除表征MSC的分化，還檢測了成骨分化干細胞的功能活性。已知在緩慢松弛的藻酸鹽凝膠、PEG凝膠、可降解的透明質酸凝膠，或觸變性PEG硅膠的3D基質中，MSC向成骨分化。然而尚無研究發現這些分化的細胞形成相互連接的、礦化的和富含Ⅰ型膠原的基質（骨的三個關鍵結構特征）。本研究利用Von Kossa染色、免疫組化和能量色散x光光譜（EDS）顯示，應力松弛較快條件下培養14天后，基質礦化和Ⅰ型膠原沉積都得到增強（圖3c、d）。在應力松弛時間約1min的快速松弛凝膠中，MSC形成相互連接的骨樣基質，該應力松弛時間接近早期骨折血腫的時間（圖1a）。這一結果表明，快速松弛凝膠不僅能促進zuida限度的成骨，還能使成骨分化的干細胞具有成骨活性。

圖3 MSCs向成骨分化并僅在快速松弛凝膠中形成相互連接的富含礦化Ⅰ型膠原的基質。（a）油紅O（ORO）染色冷凍切片，（紅色）表示成脂分化，ALP染色（藍色）表示早期成骨分化。（b）ORO染色陽性細胞百分比定量，細胞裂解物中ALP活性定量。隨著應力松弛的加快，成骨分化顯著增加。（c）培養2周后凝膠冷凍切片上Von Kossa（礦化）和Ⅰ型膠原染色。（d）培養2周后，凝膠切片的掃描電子顯微和SEM-EDS圖像。磷元素圖（紅色）覆蓋在相應的反向散射SEM圖像上。

       在發現初始彈性模量和應力松弛率對MSC分化和骨形成活性的強烈影響后，研究了快速應力松弛促進這些行為的潛在機制。鑒于細胞通過與胞外基質配體的結合來感知胞外基質中的機械信號，因此首先檢查了RGD密度對MSC分化的影響（圖4a）。在150 μm的較低RGD密度下，在初始彈性模量17 kPa的水凝膠中觀察到應力松弛更快，成骨增強趨勢更強，但成骨分化的程度相對于較高RGD密度顯著降低（圖4a）。表明應力松弛對成骨分化的影響是通過胞外基質配體介導的。細胞通過整合素受體與細胞外基質配體結合。使用識別抗體顯示在松弛更快的凝膠中，β1整聯蛋白向細胞外周的定位增加（圖4b）。但沒有觀察到樁蛋白paxillin在細胞周圍的定位，這表明在這種3D材料系統中，任何應力松弛水平下都沒有形成常規的局部粘連。已知配體聚集與成骨分化相關，使用基于熒光共振能量轉移（FRET）的技術評估RGD配體聚集。在包裹了細胞的快和慢松弛凝膠中，共聚焦顯微鏡分析偶聯到藻酸鹽上的熒光素-RGD和TAMRA-RGD間的FRET（圖4c，d）。在培養18h后，松弛較快凝膠中與MSC相鄰的水凝膠區域檢測到的能量轉移，相較松弛較慢凝膠程度更高（圖4e）。在快速松弛凝膠中，細胞周圍整個區域的FRET一般都是增強的。由于FRET信號可靈敏反應供體和受體熒光團之間的距離，證明了RGD配體的聚集，以及在松弛更快、初始彈性模量17kPa的水凝膠中，細胞對水凝膠的局部機械重塑。盡管在松弛更快、初始彈性模量9kPa的凝膠中，觀察到類似的RGD配體聚集增趨勢，但轉移程度顯著低于更硬的快速松弛凝膠。

       由于整合素的結合和聚集激活了信號通路，研究人員探究了不同應力松弛水平的凝膠中，信號通路在介導成骨中的作用。已知細胞通過肌動球蛋白收縮（通常激活Rho信號通路介導）感知胞外基質的硬度，并通過激活Rac信號通路感知2D丙烯酰胺基質的損失模量。對包裹于初始彈性模量17kPa水凝膠中的MSC，通過藥理學抑制myosin、Rho和Rac1。ML-7對myosin輕鏈激酶的抑制使成骨作用減少，表明快速應力松弛基質中成骨作用的增強涉及myosin的收縮性（圖4f）。Y-27632抑制Rho會促進成骨（圖4g）。用NSC 23766抑制Rac1對成骨沒有顯著影響（圖4h）。

圖4 較硬水凝膠中，通過ECM配體密度、RGD配體聚集增加、myosin收縮性介導的MSC成骨分化。（a）包裹于水凝膠的MSC中ALP活性定量。（b）培養一周的MSC中，actin（綠色）、細胞核（藍色）和β1整合素（紅色）的免疫熒光染色。（c）RGD-熒光與RGD-羅丹明間的FRET分析。（d）培養18h后，不同應力松弛特性水凝膠中，MSCs周圍水凝膠中的FRET受體信號（紅色）和細胞核（DAPI/藍色）的共焦顯微鏡圖像。空白點表示細胞的位置。（e）細胞邊界2-3μm范圍內，定量FRET受體信號的增強。（f）ML-7（myosin輕鏈激酶抑制劑）存在時MSC的ALP活性。（g）Y-27632（Rho激酶抑制劑）存在下，MSC的ALP活性。（h）NSC 23766（Rac1抑制劑）存在下，MSC的ALP活性。

       接下來檢查了YAP轉錄調節因子的核定位。YAP轉錄調節因子被認為是細胞機械或幾何應答中，控制細胞基因表達的關鍵調節元件。已知2D丙烯酰胺基質上培養的MSC在基質硬度改變時，YAP的核定位可指導MSC分化為成脂或成骨細胞。研究發現隨著應力松弛更快，YAP的核易位增加，表明基質應力松弛對轉錄因子活性有影響。不同彈性模量間核YAP的水平變化的范圍相同（圖5a，b）。由于成脂分化主要在彈性模量約9kPa的基質中觀察到，成骨分化主要在彈性模量約17kPa的基質中觀察到，證明YAP的核易位與MSC命運無關（圖5c，d）。表明在3D培養的MSC中，YAP的定位本身并不能控制細胞分化。

圖5 YAP核定位可通過較快的應力松弛得到增強，但與MSC命運無關。（a）培養一周的MSC中，免疫熒光染色actin（綠色）、細胞核（藍色）和YAP（紅色）。（b）核YAP與細胞骨架YAP濃度的定量比率。核YAP隨著更快的應力松弛而顯著增加。（c）量化ORO染色陽性的D1細胞百分比，作為相對核YAP的函數。（d）量化分化的D1細胞中ALP，作為相對核YAP的函數。

結論

       本研究展示了一種調節藻酸鹽水凝膠應力松弛性質的方法，并指出基質應力松弛對細胞生物學有深刻影響。強調了將基質應力松弛視為理解細胞-胞外基質相互作用、機械轉導基礎生物物理學的基本信號是非常重要的，因為大多數生理性的細胞外基質都表現出一定程度的應力松弛。在組織工程應用中，應力松弛可作為一個材料設計參數，特別是調節細胞增殖和促進骨再生方面。

參考文獻：

Chaudhuri,  O. , et al. "Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem  cell fate and activity." Nature Materials 15.3(2016):326-334.