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New Phytologist:DAP-seq技術在陸地棉體細胞胚胎發(fā)生調控機制研究中的應用

來源:藍景科信河北生物科技有限公司   2023年08月08日 11:29  

體細胞胚胎發(fā)生(Somatic embryogenesis, SE)可以不經(jīng)過配子融合,由體細胞分化發(fā)育成整個植株。SE是一個多因素的發(fā)育過程,也是研究細胞全能性的理想模型。目前,SE在多個領域得到了應用,例如:種質保護、人工種子生產(chǎn)、單倍體育種、無性繁殖,以及作為植物生物技術研究領域的平臺工具。然而,目前對SE調控機制的理解僅限于少數(shù)模式植物(例如:擬南芥),而且不同物種之間SE調控機制存在很大差異。因此,深入研究重要經(jīng)濟作物棉花的SE調控機制對棉花育種和繁殖具有重要的意義。


2023年7月11日,鄭州大學與中棉所棉花生物學國家重點實驗室的研究成果發(fā)表在New Phytologist(IF=9.4,Q1區(qū))期刊上,題目為“GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了陸地棉GhMYC3的結合基序和靶基因。揭示了GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18轉錄級聯(lián)調控棉花SE的分子機制,為細胞全能性以及棉花基因工程研究提供了新思路。



1. GhMYC3是棉花SE過程中一個重要的調控因子

通過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析,在陸地棉中篩選到一個與Homo-MYC具有高度系統(tǒng)發(fā)育相似性的同源基因GhMYC3,具有1個bHLH和1個bHLH-MYC_N結構域。于是假設GhMYC3在決定細胞命運方面具有與人類MYC相似的生理功能。

為研究GhMYC3對SE過程中細胞命運轉變的影響,構建了過表達GhMYC3的棉花轉基因系(OE-GhMYC3)。表型分析發(fā)現(xiàn)過表達GhMYC3顯著誘導了SE,促進愈傷組織生長。隨后,GhMYC3的RNAi細胞系(Ri-MYC3)表型分析發(fā)現(xiàn)Ri-GhMYC3與WT的愈傷組織形成率一致,但新鮮愈傷組織的重量(FW)略輕,胚性愈傷組織(EC)分化率顯著降低。以上結果表明,GhMYC3促進棉花體細胞向愈傷組織的去分化,但阻止了向EC的轉變過程。

GhMYC3調控棉花SE過程

(a) 智人、陸地棉、擬南芥中MYC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。(b) 棉花SE過程示意圖。下胚軸作為外植體,用愈傷組織誘導培養(yǎng)基培養(yǎng),體細胞去分化形成愈傷組織,在60-90天的生長過程中,增殖的愈傷組織重新分化為EC,EC發(fā)育成體細胞胚,而后在體細胞胚誘導培養(yǎng)基上萌發(fā)為幼苗。(c) WT、OE-GhMYC3Ri-GhMYC3在EC分化過程中的形態(tài)差異。(d) 長日照下生長的WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3植株葉片組織中GhMYC3的相對表達量。(e) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3愈傷組織的FW。(f) WT、OE-GhMYC3Ri-GhMYC3的EC分化率。


2. GhMYC3直接與GhMYB44GhLBD18的啟動子結合,調控其表達

DAP-seq分析鑒定了GhMYC3的DNA結合基序及其下游靶基因。鑒于愈傷組織形成和根系生長具有共同的調控途徑,作者鑒定到了與根系發(fā)育和生長素信號通路有關的2個靶基因GhMYB44GhLBD18亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3、GhMYB44和GhLBD18主要表達于細胞核。在GhMYB44GhLBD18的啟動子中存在與GhMYC3結合的G-box(CACGTT)元件。酵母單雜交(Y1H)和電泳遷移率(EMSA)實驗驗證了GhMYC3特異性地結合GhMYB44GhLBD18啟動子中的G-box基序。另外,煙草葉片瞬時表達分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3以G-box依賴的方式激活GhLBD18的轉錄,抑制GhMYB44的轉錄。

GhMYC3直接結合并調控GhMYB44GhLBD18的轉錄

(a) GhMYC3的結合序列在基因組上的分布。(b) GhMYC3的主要結合基序CA T/C GT T/G。(c) GhMYC3下游基因的GO富集分析。(d) GhMYB44GhLBD18啟動子序列中包含G-box基序。(e) Y1H實驗。(f) EMSA實驗。(g-h) 煙草葉片瞬時表達分析及LUC熒光強度統(tǒng)計。


3. GhMYB44與GhLBD18的啟動子直接相互作用,抑制其表達

DAP-seq分析發(fā)現(xiàn)在GhLBD18啟動子中存在MYB轉錄因子結合位點。Y1H和EMSA實驗驗證了GhMYB44與GhLBD18啟動子的直接結合。瞬時基因表達分析表明GhMYB44通過直接結合GhLBD18的啟動子序列抑制其表達。以上結果表明,GhMYC3除了通過與GhLBD18啟動子特定位點結合直接激活GhLBD18的表達外,還通過GhMYB44-GhLBD18轉錄級聯(lián)信號間接調控GhLBD18的表達。


4. GhMYB44通過GhLBD18調控SE過程

利用OE-GhMYB44SRDX-GhMYB44(特異性沉默系)和OEGhLBD18棉花株系進一步研究MYB44調控SE的過程。與WT相比,在OE-GhMYB44中愈傷組織起始延緩,愈傷組織增殖減弱,EC分化加速;相反,在SRDX-GhMYB44OE-GhLBD18中愈傷組織起始提前,愈傷組織增殖增強,EC分化延遲。因此,GhMYB44在GhLBD18的上游發(fā)揮作用,在愈傷組織起始、愈傷細胞增殖和愈傷組織向EC的轉變過程中控制細胞命運的決定。


5. GhRCD1與GhMYC3相互作用調節(jié)SE過程

采用酵母雙雜交(Y2H)鑒定到在SE過程中與GhMYC3互作的蛋白GhRCD1,該蛋白在愈傷組織和EC形成的不同階段均被誘導,但在體細胞胚中保持較低水平。雙分子熒光互補(BiFC)實驗、Pull down實驗、LUC互補實驗證明了GhMYC3與GhRCD1蛋白有相互作用。GhRCD1的敲除突變體(KO-GhRCD1)和過表達轉基因系(OE-GhRCD1)實驗分析發(fā)現(xiàn),與WT相比KO-GhRCD1表現(xiàn)出愈傷組織起始提早,生長加快,F(xiàn)W增加;而與WT和KO-GhRCD1相比,OE-GhRCD1表現(xiàn)為愈傷組織起始延遲,增殖減少,EC分化率降低。結果表明,RCD1的適當表達對SE過程至關重要,但RCD1的過表達或突變均不利于愈傷組織細胞的命運轉變過程。

GhRCD1與GhMYC3相互作用

(a) Y2H實驗。(b) BiFC實驗。(c) Pull down實驗。(d) LUC互補實驗。(e-g) KO-GhRCD1OE-GhRCD1在SE不同發(fā)育階段的形態(tài)學分析(e)、FW分析(f)和EC分化率分析(g)。


6. GhRCD1拮抗GhMYC3調控下游靶基因的轉錄能力

使用雙熒光素酶報告(Dual-luc)實驗檢測GhRCD1是否影響GhMYC3對其下游靶點的轉錄調控。將LUC報告基因分別與GhMYB44GhLBD18啟動子融合,再通過瞬時轉染測定啟動子活性。GhMYC3的過表達抑制了GhMYB44啟動子驅動的LUC表達,但過表達GhRCD1削弱了這種抑制作用;GhMYC3增強了GhLBD18啟動子驅動的LUC表達,而過表達GhRCD1削弱了這種增強作用。此外,GhMYB44能夠直接抑制GhLBD18的表達,但GhMYB44和GhMYC3共表達導致GhLBD18啟動子驅動的LUC表達水平顯著高于單獨表達GhMYB44,這表明GhMYC3直接干擾了GhMYB44對GhLBD18的轉錄調控。qRT-PCR檢測結果表明GhMYB44的表達水平與GhMYC3的表達呈負相關。GhLBD18OE-GhMYC3SRDX-GhMYB44中表達上調,而在Ri-GhMYC3細胞系中表達下調??傊?,在SE過程中GhRCD1抑制GhMYC3對GhMYB44GhLBD18的表達調控能力。


7. 由RCD1-MYC3-MYB44-LBD18級聯(lián)介導的活性氧穩(wěn)態(tài)調節(jié)細胞命運轉變

利用ROS熒光探針H2DCF和BCIP-NBT檢測SE不同發(fā)育階段的ROS積累,發(fā)現(xiàn)ROS最初在外植體階段的損傷組織中增加,細胞內(nèi)ROS水平與愈傷組織細胞增殖呈正相關,第21 d時在發(fā)育的愈傷組織中觀察到氧化爆發(fā)。在EC發(fā)育過程中,ROS在愈傷組織的胚性前區(qū)富集,但在其他部位枯竭。過表達GhMYC3GhLBD18導致ROS積累,促進愈傷組織細胞增殖,然而過表達GhMYB44則相反。最后,該研究提出了一個愈傷組織形成和SE的模型。在下胚軸外植體培養(yǎng)的不同發(fā)育階段,GhRCD1、GhMYC3、GhMYB44GhLBD18的表達水平與細胞命運決定和細胞分化動態(tài)緊密相關。這些基因的精確時空表達可調節(jié)細胞內(nèi)ROS的積累,進而影響SE過程中的細胞命運轉變。

GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18信號級聯(lián)調控SE的機制模型圖

在愈傷組織誘導過程中,GhMYC3通過調控GhMYB44GhLBD18的轉錄,進一步激活ROS依賴的信號通路,使ROS優(yōu)先在誘導部位積累,并在愈傷組織增殖過程中達到峰值。在EC獲得過程中,較高水平的GhRCD1可能抑制GhMYC3對GhMYB44GhLBD18的轉錄調控,從而相應地減少ROS的積累,而且ROS在EC周圍呈極性分布。


本文小結:該研究揭示了SE過程中細胞命運轉變的調控網(wǎng)絡。GhMYC3通過結合GhMYB44GhLBD18啟動子中的G-box元件調節(jié)其表達。GhRCD1拮抗GhMYC3對下游靶基因的轉錄調控能力。GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18組成的轉錄級聯(lián)模塊呈現(xiàn)時序表達模式,并時序性的調節(jié)細胞內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài),進而影響SE過程中細胞的命運。


參考文獻:Yuan J, Liu X, Zhao H, Wang Y, Wei X, Wang P, Zhan J, Liu L, Li F, Ge X. GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade. New Phytol. 2023. doi: 10.1111/nph.19120. (IF=10.323)

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