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海洋微生物調查技術要求和調查要素

技術要求

采樣站位和層次

a)站位布設應盡量和其他調查項目一致;

b) 采樣水層見表1,但可去除5 m水層;大洋調查可增加500 m.1 000 m.2 000 m.....等水層的采樣;

c) 海洋沉積物中微生物取樣層次,大面調查取表層;斷面調查時,將巖芯管以3cm間隔分層;對于特殊調查項目,可根據實際需要確定采樣層次。

無菌操作

a) 采水器上的采樣瓶、袋應預先滅菌;

b) 實驗室內水.泥樣分樣和分離培養鑒定過程中,均按無菌操作要求進行;

c) 其他凡屬海上調查所需物品，如水樣貯存瓶(棕色)、移液管(1 cm*、5 cm*、10 cm')、培養皿等均需洗凈,包封滅菌、足量備用。

樣品保存

樣品應在采樣后2 h內處理、分析。若暫放冰箱保存，不得超過24 h。

調查要素

海洋微生物調查要素為:海洋微生物現存量,即病毒、細菌總數與微生物其他類群(放線菌、酵母、霉.菌等)的豐度和海洋微生物的活性，即細菌生產力、微生物異養活性、生態呼吸率的測定。

采樣

主要儀器設備

采水器

根據采樣深度,選用尼斯金采水器或擊開式采水器。

采泥器

箱式采樣器、多管采樣器或彈簧采泥器,見小型底棲生物調查的采樣器。

采水樣

a)按實際情況選用采水器;

b) 采水器開啟后,應停留片刻,待水樣裝滿;

c) 按測定項目計算采水量,若同一水層分幾次采樣,樣品應混勻,再按各測定項目要求分裝、處理。

采泥樣

用無菌工具從預定層次中取10 g~20 g樣品,置于無菌容器。

樣品分析

主要儀器設備

熒光顯微鏡

具備藍光道和紫外光道供觀察吖啶橙和DAPI染色,配置照相機或高分辨率并適用于弱光場的數碼相機。

液體閃爍計數儀

具有測定"C和H的功能。

恒溫培養箱

具有測定"C和"H的功能。

恒溫培養箱

控溫范圍:5C~50C。

抽濾裝置

進口成品濾器組或自行裝配25mm和47mm濾器和負壓抽濾設備。放射性同位素示蹤測試的抽濾設備必須專用,不能與微生物計數混用。

移液槍

置備不同功用的移液槍。

微生物自動鑒定儀

現有的微生物鑒定儀器主要應用于醫學微生物鑒定,有條件的單位選用較適用于環境微生物鑒定的儀器產品。

消耗性材料

濾膜

a) 微孔濾膜(材料:醋酸纖維或硝化纖維):直徑25 mm和47 mm,孔徑0.2 μm、0.45 μm和0.8 μm;

b) 黑色核孔濾膜(材料:聚碳酸酯):直徑25 mm,孔徑0.2 μm;

c) 氧化鋁濾膜:直徑25 mm,孔徑0. 02 μm。

注射器和濾器

一次性和0.2μm無菌濾器。

熒光顯微鏡計數用的裝樣瓶

a)50cm3螺蓋聚丙烯瓶:用前用5%HCl溶液浸泡1d以上,并經0.02μm濾膜過濾的蒸餾水漱洗并高壓滅菌;

b)50cm3螺蓋塑料瓶:用前用5%HCl溶液浸泡1d以上,并經0.2um濾膜過濾的蒸餾水漱洗并高壓滅菌。

同位素示蹤培養瓶和閃爍計數瓶

a) 50 cm3螺蓋培養管;

b)125cm3螺蓋培養瓶;

c)20cm3或7cm’與閃爍儀匹配的玻璃或塑料閃爍瓶。

玻璃器皿

培養皿、BOD培養瓶和常用玻璃器皿。

培養基、試劑和工作溶液

培養計數用的培養基、試劑

陳海水

取天然海水避光保存3個月以上,使用時取其清液或經0.45μm濾膜過濾的濾液。

表面活性劑.

將吐溫- 80(Tween-80)按體積分數為1 : 2 000比例配成水溶液(工作液)高壓滅菌備用。

樣品處理

水樣處理

外熒光直接計數的水樣

a) 病毒計數:取水樣50 cm2于預先處理的采樣瓶中,加2.5 cm2(甲醛在樣品中的質量濃度為2%)固定樣品,樣品應立即分析,否則應在4C避光保存,但只能保存一周。

b) 細菌計數:取水樣50 cm2于預先處理的采樣瓶中,加2.5 cm2* (甲醛在樣品中的質量濃度為2%)固定樣品,樣品于2C~8C低溫保存。濾膜萌發、平板計數的水樣按10cm3/dm'量加滅菌的吐溫一80工作溶液。

細菌生產力水樣

a)[甲基-3H]胸腺嘧啶核苷示蹤水樣取3支50 cm2帶螺蓋培養管,各加入20 cm2水樣,其中- -管加1 cm°甲醛混勻為對照,再向各管加人[甲基~H]胸腺嘧啶核苷工作溶液，使其終濃度為250 nmol/dm°(即加入1 cm3 該示蹤劑的工作溶液),混勻,置現場溫度培養1 h,再加人1 cm2甲醛于測樣瓶中搖均,以終止培養并保存于冰箱。對活性較低的水體,應適當延長培養時間。

b) [2 H]示蹤水樣用[4,5-3 H]代替[甲基-3 H]胸腺嘧啶核苷,使其在樣品中的最終濃度為20 nmol/dm2 (即加20 mm示蹤劑于20 cm樣品中),其余步驟同上。

微生物異養活性測定的水樣

取3個125 cm3帶螺蓋三角瓶,各加入100cm3水樣,其中1瓶加入5cm2作對照,再向各瓶加入D-[UL-"C]葡萄糖工作溶液1 cm3 ,蓋緊混勻，置現場水溫暗培養1 h后,加入5 cm3甲醛于測樣中,搖勻以終止培養。

生態呼吸率測定水樣

將水樣按溶解氧測定要求注入4個250 cm2* BOD培養瓶中,其中2瓶立即固定,另2瓶置暗處于現場水溫條件下培養1d后,取出固定。對寡營養水體的樣品應適當延長培養時間。

泥樣處理

微生物計數泥樣取約2 g泥樣,精確稱重后,置于裝有含吐溫一80(10 cm*/dm3)的18 cm3海水并加玻璃珠的無菌三角瓶中,充分播蕩,制成懸浮液。

測定干重泥樣

保存余下的泥樣供測干重。

記錄

將以上結果分別記錄于表。

樣品分析

水樣微生物計數

微生物計數包括針對總菌數的“直接計數”和針對可培養微生物的“培養計數”。“直接計數”采用落射熒光顯微鏡,有條件的應采用流式細胞儀。

熒光顯微鏡直接計數

SYBR Green I直接計數法

適用于測定病毒總數。也可同時測定細菌總數,但在病毒顆粒分布的視野中,細菌數偏少,且制片操作步驟繁瑣、氧化鋁濾膜價格目前是核孔濾膜的4倍。其工作程序如下:

a)濾器裝配:長期未用的濾器應先裝好濾器和抽濾裝置,用經0.02μm過濾的高壓滅菌蒸餾水加滿濾簡并抽濾清洗2次或3次,(當天使用的濾器,在各個樣品測定前用同樣方法清洗一次，清洗時不必取下襯墊濾膜),再卸下濾筒在濾板上先放置孔徑為0. 45 pμm或0.8 μm的25 mm微孔濾膜作襯底(襯底可多次使用);然后將孔徑為0.02 μm氧化鋁濾膜放于襯墊上,再裝配.好濾筒;

b)配制染色劑:臨用前,取出SYBRGreenI儲備液(6.3.2.2.2a)),用經0.02μm過濾的無菌去離子水按1:10稀釋(如加5mm'儲備液到45mm’稀釋水中),操作必須在弱光環境中進行，未用完的儲備液應立即放回一20C冰箱避光保存;

c) 配制熒光保護劑工作液:臨用前取10% p-苯二胺儲備液(6.3.2.2.2 b))、化霜、播勻后,吸取10 mm3與990 mm'PBS甘油儲備液(6.3.2.2.2 b))混合,制成工作液,該工作液應避光、置冰浴,未用完的10% p-苯二胺儲備液應立即再行冷凍,但該儲備液管累計凍、融3次后,便須丟棄;如果p-苯二胺儲備液或熒光保護劑工作液呈棕色,棄之不用并重新配制;

d) 加樣:加入適量樣品(1 cm'~10 cm3，即視野病毒數控制在50個左右),若樣品量少于1 cm3則應先加入2 cm°經0. 02 μm過濾的無菌海水,再加樣,以便病毒、細菌均勻分布于濾膜上;

e) 抽濾:在負壓(15 kPa~20 kPa)條件下,把樣品抽濾至干,卸下濾筒;

f) 染色:吸取97.5 mm3經0.02 μm過濾的無菌去離子水,滴人干凈的無菌塑料培養皿,再向該水滴加入2.5 μL 10% SYBR Green I染色劑工作液(此時,染色劑濃度為0. 25%),培養皿及染色劑需置于冰浴、避光處;用扁平頭鑷子在負壓狀態下,取下載有樣品的氧化鋁濾膜,將膜的背面(非載樣面)放在培養皿的染色液滴上冰浴、避光染色15min;

g) 制片:染色后,取出濾膜,吸干貼上濾膜背面及邊緣的液滴,把濾膜緊貼于載玻片上(載樣面朝上),并在蓋玻片上加30 mm°熒光保護劑工作液,具液面朝下蓋緊濾膜(濾膜上下兩面均不能有氣泡),用指甲油密封蓋玻片四周,制片在一20C條件下可保存2周~3周,但以立即計數為宜;

h)計數:在熒光顯微鏡藍色激發光道、油鏡條件下，病毒顆粒呈針扎(pinprick)狀、亮綠色,細菌細胞亦呈亮綠色,但其亮度強于病毒顆粒,且菌體比病毒顆粒大得多。隨機取10個~20個視野,計算病毒顆粒數(如果要同時計算細菌數的話,還需計算具有細菌形態的細胞數),每個樣品至少計數200個病毒(或細菌);

i) 每次(不同測定日期)測定時,應加測不加樣品的空白對照,對于空白制片,每個視野不得出現1個以上病毒(或細菌)。

j)計算樣品含病毒顆粒數

吖啶橙直接計數法

適用于測定細菌總數，工作程序如下:

a)濾器裝配:長期未用的濾器應先裝好濾器和抽濾裝置,用經0.2μm過濾的高壓滅菌蒸餾水加滿濾簡并抽濾清洗2次或3次,(當天使用的濾器,在各個樣品測定前用同樣方法清洗-一次,清洗時不必取下襯墊濾膜),再卸下濾簡在濾板上先放置孔徑為0.8μm或0.45 μm的25 mm微孔濾膜作襯底(襯底可多次使用);然后將黑色核孔濾膜(光滑面朝上)放于襯墊上,再裝配好濾筒;

b) 加樣:加人適量樣品(控制在視野出現菌體50個左右),若樣品量少于1 cm’則應先加人2 cm3經0.2 μm過濾的無菌海水,再加樣,以便細菌均勻分布于濾膜上;

c)抽濾:在負壓(50kPa)條件下,把樣品抽濾至濾膜剛好呈濕潤狀態,并釋放真空;

d) 染色:用吸取吖啶橙工作液,套上0.2 pμm無菌濾器,沿濾筒壁加入約1 cm3染色液，使其蓋滿濾膜并染色5 min~10 min。而后在同樣負壓下抽濾至干;

e) 制片:在載玻片上加一小滴無熒光鏡油,貼上濾膜(載菌一面朝上),并在蓋玻片上加一小滴同樣鏡油,具油面朝下蓋緊濾膜(濾膜上下兩面均不能有氣泡),用指甲油密封蓋玻片四周,制片在一20C條件下可保存數月,但以立即計數為宜;

f)計數:在熒光顯微鏡藍光道,油鏡條件下,隨機取10個視野,計算具有細菌形態呈亮綠色的細胞數;每個樣品至少計數300個菌體;每次(不同測定日期)測定時,應加測不加樣品的空白對照,空白制片,每個視野不得出現1個以上細菌;

 DAPI直接計數法

適用于測定細菌總數,和吖啶橙染色法相比,背景更清晰,熒光色素干擾較少,菌體著色不易衰減但需要用紫外光激發濾光系統(即:G 365激發濾光片,FT 395分射濾光片,LP 420吸收濾光片)的顯微鏡觀察。其工作程序除了用DAPI工作溶液(即:10 ug/cm2)代替吖啶橙染色液外,其余步驟均相同。當本計數法與吖啶直接計數法的計數結果有異議時,以本計數法為仲裁計數法。

細菌體積測定一顯微攝影、幻燈測量法

細菌生物量(以C計)與細菌個體大小相關。通過測定細菌體積并借助于經驗轉換系數,把細菌轉化為細菌生物量。已有許多方法應用于測量細菌體積,數碼攝像并帶影像自動分析軟件系統屬較的技術,需要大資金的設備投入,而顯微攝影- -一幻燈測量法系普 及型技術,具體工作程序如下:

a) 膠卷安裝和系統測試:選用ASA 400彩色反轉片膠卷,按顯微攝影要求操作,并通過測試比較,選擇適當的曝光組合;

b) 樣品拍照:在熒光計數時,選擇5個~10個菌數較多的視野,進行拍照，以便在照片上獲得足夠多的菌體。同時記錄照片序號和相對應的樣品號;

c)標尺拍照:在與細菌直接計數相同放大倍數條件下,利用顯微鏡普通光系統,清晰地拍照臺圍尺標度;

d) 制備幻燈投影:沖洗拍照的膠卷, 制成幻燈片,裝人幻燈機,投影于貼白紙的墻壁上;

e) 菌體測量:用游標卡尺測量幻燈投影臺微尺的長度,注意測量不同部位的長度,以便獲得統計平均值。選擇輪廓清晰的菌體,測量其長度和寬度,并作記錄。每測完一個菌體,應立即作標記,以防重復測量;

f)細菌體積計算:先根據臺微尺刻度實際長度和幻燈投影上測量長度的放大比例,計算出被測細菌實際長度和寬度,然后按下述公式,計算細菌體積;

培養計數法

濾膜萌發計數法

適用于測定微生物活菌數,多用于水深大于200 m的海區。工作程序如下:

a) 濾膜處理:使用前, 微孔濾膜(孔徑0.2 pm,直徑47 mm)用鋁箔紙包好,高壓滅菌;

b) 濾器裝配:不用加襯墊;

c) 加樣:加適量樣品(以每片濾膜出現30個~50個左右的菌落為宜),若加樣量少,應添加適量高壓滅菌海水稀釋;用于放線菌.酵母.霉菌計數的樣品，加樣量應略大;每個樣品一般取兩種過濾量，每種過濾量重復三片濾膜;

d) 抽濾:;

e) 培養:將濾膜粗糙面(即:沒有載濾物的一面)緊貼于備好的平板培養基上(濾膜和培養基間不得有氣泡),將平板倒置于接近樣品現場溫度的恒溫箱培養4d~15d;

f)計數:在放大鏡下或用菌落計數器,按菌落形態，分別計算各種培養基中四大菌類的菌落數(必要時,用顯微鏡觀察確證);

g)計算樣品含菌數

微生物分類鑒定

條件許可時應進行微生物分類鑒定。

菌種分離、純化和保存

用接種針從微生物培養計數的平板或濾膜上挑取全部菌落或部分區域的所有菌落,挑取時注意選擇形態特征不同的菌落,挑取的菌落在新平板上反復劃線分離,培養數天,選取新形成的單菌落,直至純種,再接于斜面培養,長成后置冰箱保存待鑒定;如果不是純種,應繼續純化。

種類鑒定

種類鑒定方法包括傳統鑒定法、儀器自動鑒定法和分子生物學鑒定法。

菌種保藏

對一些有代表性或有保存價值的菌種,按菌種保藏法的要求，登記入庫,長期保存。

資料整理

利用計算機保存分析、計算數據、制作報表、繪制分布圖。

填寫報表

按本部分的有關規定填寫。

分別將病毒、細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的數量(包括細菌生物量)以及細菌生產力和細菌異養活性的測定結果。

繪制分布圖

斷面分布圖

一般以等值線表示,取值標準視具體情況而定。

a)微生物數量和細菌生物量斷面分布圖;

b)細菌生產力斷面分布圖;

c)微生物異養活性斷面分布圖;

d)生態呼吸率斷面分布圖。

大面分布圖

一般以等值線表示,取值標準視具體情況而定。

a)微生物數量和細菌生物量大面分布圖;

b)細菌生產 力大面分布圖;

c)微生物異養活性大面分布圖;

d)生態呼吸率大面分布圖。