細胞體外暴露方法的一個重要問題及CULTEX的優化方案

由于歐盟關于化學物質的毒性風險評估（REACH EC No.1907/2006）法規的改變，以及目前不斷發展的替代方法的需求，以取代動物實驗為目標，在體外模型基礎上進行肺毒性的評估的技術，顯然是非常有必要的。迄今為止，國內外的細胞體外毒性測試實驗研究中，仍多采用浸沒式細胞培養方法進行。然而，在浸沒條件下的顆粒物暴露并不符合在細胞體內的真實情況，并可能影響研究受試物（顆粒物、氣體等）的物理化學性質。早在1999年，德國Aufderheide教授便首先提出了細胞空氣-液體界技術，并隨后研制了專門的體外暴露設備的**代Cultex細胞暴露系統，用于對體外肺細胞在空氣-液體界面直接進行各種受試物的暴露。這一系統符合細胞在空氣-液體界面進行顆粒暴露的所有要求，從而初步成功的建立了受試物急性肺毒性評價的體外模型。

肺細胞在氣-液界面暴露染毒技術模擬體內真實條件的同時，發現該方法可能出現一個嚴重的問題：潔凈空氣對照組的細胞存活率，與培養箱內細胞相比有明顯降低（僅為培養箱內細胞存活率的40%~60%，如下圖1）。此問題的出現意味著，實驗組細胞損傷的原因更加復雜了，所獲得實驗數據的意義降低了。為此，如下文細胞體外暴露方法的一個重要問題及CULTEX的優化方案將予以詳細介紹。

圖1 圖2

為了完善體外細胞氣-液界面暴露方法，德國CULTEX^® Laboratories實驗人員進行了大量改進性實驗，通過對CULTEX 暴露模塊結構、細胞培養選材、氣路設計與氣流控制、實驗操作流程等多個方面（由于優化方案中所用方法及數據全部是根據CULTEX RFS的尺寸及氣路設計進行大量實驗基礎上獲得的，所以此方案僅適用于CULTEX RFS系統）進行調整優化處理：

實驗材料：人肺腺癌上皮細胞系A549（CCL-185, ATCC）被用于暴露實驗。A549細胞在Dulbecco’s Modified Eagle’s培養基生長（DMEM）（Biochrom,Germany）含10%胎牛血清（FCS Gold, PAA Laboratories, Germany）和1%/（Gibco Life Technologies, Germany）。

實驗中，A549細胞種在BD Falcon（PET膜，4.2 cm2, 孔徑 0.4 μm, 孔密度 2.0 ± 0.2 × 106, BD Falcon, Germany）或者Corning Transwell（PET 膜, 4.67 cm2, 孔徑 0.4 μm, 孔密度 4.0 × 106, Corning, Germany）細胞小室中，以密度1.2 × 105 cells/cm2，條件37 °C and 5% CO2 （標準條件）培養24h。

細胞體外暴露方法的一個重要問題及CULTEX的優化方案的優化方法：

1、 CULTEX RFS模塊主要結構的優化

eq /o/ac(○,1)1 CULTEX RFS模塊是細胞體外培養與暴露的核心結構，與**代的線性CLUTEX模塊相比，RFS模塊采用輻射流（Radial FlowSystem）結構，此結構不僅可以使顆粒物氣溶膠在細胞表面沉積更均勻，重復性更高。同時，該結構在進氣流分配、過載氣流釋放、廢氣氣流排出上更加同步均一，便于統一控制氣流壓力；

eq /o/ac(○,2)2 系統優化了過載氣體預排出通道的結構設計，該設計把系統過載氣體排出對腔室內壓力的影響降到*低，同時更可以把氣體中可能混合的雜質一同排出，減少污染空氣對細胞影響； eq /o/ac(○,3)3 氣體噴嘴可替換，根據市售的不同品牌的tranwell小室，CULTEX對應開發了與之適用的氣體噴嘴，減少氣體因噴嘴與小室不適用而造成對細胞的壓力； eq /o/ac(○,4)4 RFS暴露的開啟和關閉，僅需要旋轉開閉旋鈕即可完成，不僅使系統的操作更簡單、快捷，更重要的是其氣密性更加完好，不會因操作漏氣而對細胞的意外影響。

2、CULTEX RFS系統氣體流量控制設計優化

CULTEX RFS系統的氣流控制是通過真空+質量流量控制器進行的， eq /o/ac(○,1)1 CULTEX工程師們在對廢氣處理端加入兩個氣流緩沖結構； eq /o/ac(○,2)2優化出出*佳腔氣體流量； eq /o/ac(○,3)3 優化出*佳通氣壓力。

3、CULTEX RFS模塊操作流程優化

eq /o/ac(○,1)1 優化CULTEX RFS模塊的開啟和關閉的影響； eq /o/ac(○,2)2 膜底部的培養基是對細胞影響的*重要的因素，優化出其液面高度； eq /o/ac(○,3)3 優化模塊的清洗方法及高壓**影響。經過反復實驗后，CULTEX^® Laboratories從以上三點進行了優化并提供成熟的標準操作程序。

4、細胞培養小室選擇

細胞培養小室是細胞生長，氣溶膠暴露的關鍵場所，CULTEX^® Laboratories發現：實驗中隨著暴露時間的持續，雖然潔凈空氣暴露組內細胞活性保持穩定，但是在BD Falcon小室內的細胞卻表現出形態學上的不規則，尤其是小室位置的細胞，在30分鐘的潔凈空氣暴露后更加明顯(下圖3 A)。為此，CULTEX^® Laboratories尋找并研制了適合RFS使用的*佳的小室，在潔凈空氣暴露30分鐘后（下圖3），細胞呈均勻分布形態良好，同時細胞存活率沒有收到影響。

圖3

總之，CULTEX^® Laboratories對Cultex RFS一系列優化后的實驗結果表明，細胞體外暴露實驗中潔凈空氣對照組的細胞存活率的影響是存在的，但可以通過大量的優化處理實驗加以降低。細胞體外暴露方法的一個重要問題及CULTEX的優化方案中優化了的Cultex RFS系統進行A549細胞對清潔空氣暴露方法的，也證明Cultex RFS技術是一種很好的替代學方法，是一個重要肺毒性細胞體外模型，對吸入毒理學的發展具有重要意義。

注：細胞體外暴露方法的一個重要問題及CULTEX的優化方案的文中，數據和資料均引自CULTEX® LaboratorieGmbH，關于CULTEX細胞體外暴露方法及優化方案的更多資料和數據請咨詢德國CULTEX® Laboratorie或中國區技術服務中心北京佰樂良成科技公司。

*終使CULTEX RFS細胞暴露模塊內的細胞存活率保持與培養箱內對照組基本相同并十分穩定（如細胞體外暴露方法的一個重要問題及CULTEX的優化方案中文圖2）。