細(xì)胞體外暴露方法的一個(gè)重要問(wèn)題及CULTEX的優(yōu)化方案

由于歐盟關(guān)于化學(xué)物質(zhì)的毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（REACH EC No.1907/2006）法規(guī)的改變，以及目前不斷發(fā)展的替代方法的需求，以取代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為目標(biāo)，在體外模型基礎(chǔ)上進(jìn)行肺毒性的評(píng)估的技術(shù)，顯然是非常有必要的。迄今為止，國(guó)內(nèi)外的細(xì)胞體外毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)研究中，仍多采用浸沒(méi)式細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行。然而，在浸沒(méi)條件下的顆粒物暴露并不符合在細(xì)胞體內(nèi)的真實(shí)情況，并可能影響研究受試物（顆粒物、氣體等）的物理化學(xué)性質(zhì)。早在1999年，德國(guó)Aufderheide教授便首先提出了細(xì)胞空氣-液體界技術(shù)，并隨后研制了專門(mén)的體外暴露設(shè)備的**代Cultex細(xì)胞暴露系統(tǒng)，用于對(duì)體外肺細(xì)胞在空氣-液體界面直接進(jìn)行各種受試物的暴露。這一系統(tǒng)符合細(xì)胞在空氣-液體界面進(jìn)行顆粒暴露的所有要求，從而初步成功的建立了受試物急性肺毒性評(píng)價(jià)的體外模型。

肺細(xì)胞在氣-液界面暴露染毒技術(shù)模擬體內(nèi)真實(shí)條件的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)該方法可能出現(xiàn)一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題：潔凈空氣對(duì)照組的細(xì)胞存活率，與培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞相比有明顯降低（僅為培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞存活率的40%~60%，如下圖1）。此問(wèn)題的出現(xiàn)意味著，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞損傷的原因更加復(fù)雜了，所獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的意義降低了。為此，如下文細(xì)胞體外暴露方法的一個(gè)重要問(wèn)題及CULTEX的優(yōu)化方案將予以詳細(xì)介紹。

圖1 圖2

為了完善體外細(xì)胞氣-液界面暴露方法，德國(guó)CULTEX^® Laboratories實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行了大量改進(jìn)性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)CULTEX 暴露模塊結(jié)構(gòu)、細(xì)胞培養(yǎng)選材、氣路設(shè)計(jì)與氣流控制、實(shí)驗(yàn)操作流程等多個(gè)方面（由于優(yōu)化方案中所用方法及數(shù)據(jù)全部是根據(jù)CULTEX RFS的尺寸及氣路設(shè)計(jì)進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上獲得的，所以此方案僅適用于CULTEX RFS系統(tǒng)）進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化處理：

實(shí)驗(yàn)材料：人肺腺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549（CCL-185, ATCC）被用于暴露實(shí)驗(yàn)。A549細(xì)胞在Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基生長(zhǎng)（DMEM）（Biochrom,Germany）含10%胎牛血清（FCS Gold, PAA Laboratories, Germany）和1%/（Gibco Life Technologies, Germany）。

實(shí)驗(yàn)中，A549細(xì)胞種在BD Falcon（PET膜，4.2 cm2, 孔徑 0.4 μm, 孔密度 2.0 ± 0.2 × 106, BD Falcon, Germany）或者Corning Transwell（PET 膜, 4.67 cm2, 孔徑 0.4 μm, 孔密度 4.0 × 106, Corning, Germany）細(xì)胞小室中，以密度1.2 × 105 cells/cm2，條件37 °C and 5% CO2 （標(biāo)準(zhǔn)條件）培養(yǎng)24h。

細(xì)胞體外暴露方法的一個(gè)重要問(wèn)題及CULTEX的優(yōu)化方案的優(yōu)化方法：

1、 CULTEX RFS模塊主要結(jié)構(gòu)的優(yōu)化

eq /o/ac(○,1)1 CULTEX RFS模塊是細(xì)胞體外培養(yǎng)與暴露的核心結(jié)構(gòu)，與**代的線性CLUTEX模塊相比，RFS模塊采用輻射流（Radial FlowSystem）結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)不僅可以使顆粒物氣溶膠在細(xì)胞表面沉積更均勻，重復(fù)性更高。同時(shí)，該結(jié)構(gòu)在進(jìn)氣流分配、過(guò)載氣流釋放、廢氣氣流排出上更加同步均一，便于統(tǒng)一控制氣流壓力；

eq /o/ac(○,2)2 系統(tǒng)優(yōu)化了過(guò)載氣體預(yù)排出通道的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)把系統(tǒng)過(guò)載氣體排出對(duì)腔室內(nèi)壓力的影響降到*低，同時(shí)更可以把氣體中可能混合的雜質(zhì)一同排出，減少污染空氣對(duì)細(xì)胞影響； eq /o/ac(○,3)3 氣體噴嘴可替換，根據(jù)市售的不同品牌的tranwell小室，CULTEX對(duì)應(yīng)開(kāi)發(fā)了與之適用的氣體噴嘴，減少氣體因噴嘴與小室不適用而造成對(duì)細(xì)胞的壓力； eq /o/ac(○,4)4 RFS暴露的開(kāi)啟和關(guān)閉，僅需要旋轉(zhuǎn)開(kāi)閉旋鈕即可完成，不僅使系統(tǒng)的操作更簡(jiǎn)單、快捷，更重要的是其氣密性更加完好，不會(huì)因操作漏氣而對(duì)細(xì)胞的意外影響。

2、CULTEX RFS系統(tǒng)氣體流量控制設(shè)計(jì)優(yōu)化

CULTEX RFS系統(tǒng)的氣流控制是通過(guò)真空+質(zhì)量流量控制器進(jìn)行的， eq /o/ac(○,1)1 CULTEX工程師們?cè)趯?duì)廢氣處理端加入兩個(gè)氣流緩沖結(jié)構(gòu)； eq /o/ac(○,2)2優(yōu)化出出*佳腔氣體流量； eq /o/ac(○,3)3 優(yōu)化出*佳通氣壓力。

3、CULTEX RFS模塊操作流程優(yōu)化

eq /o/ac(○,1)1 優(yōu)化CULTEX RFS模塊的開(kāi)啟和關(guān)閉的影響； eq /o/ac(○,2)2 膜底部的培養(yǎng)基是對(duì)細(xì)胞影響的*重要的因素，優(yōu)化出其液面高度； eq /o/ac(○,3)3 優(yōu)化模塊的清洗方法及高壓**影響。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)后，CULTEX^® Laboratories從以上三點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化并提供成熟的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

4、細(xì)胞培養(yǎng)小室選擇

細(xì)胞培養(yǎng)小室是細(xì)胞生長(zhǎng)，氣溶膠暴露的關(guān)鍵場(chǎng)所，CULTEX^® Laboratories發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)中隨著暴露時(shí)間的持續(xù)，雖然潔凈空氣暴露組內(nèi)細(xì)胞活性保持穩(wěn)定，但是在BD Falcon小室內(nèi)的細(xì)胞卻表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)上的不規(guī)則，尤其是小室位置的細(xì)胞，在30分鐘的潔凈空氣暴露后更加明顯(下圖3 A)。為此，CULTEX^® Laboratories尋找并研制了適合RFS使用的*佳的小室，在潔凈空氣暴露30分鐘后（下圖3），細(xì)胞呈均勻分布形態(tài)良好，同時(shí)細(xì)胞存活率沒(méi)有收到影響。

圖3

總之，CULTEX^® Laboratories對(duì)Cultex RFS一系列優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞體外暴露實(shí)驗(yàn)中潔凈空氣對(duì)照組的細(xì)胞存活率的影響是存在的，但可以通過(guò)大量的優(yōu)化處理實(shí)驗(yàn)加以降低。細(xì)胞體外暴露方法的一個(gè)重要問(wèn)題及CULTEX的優(yōu)化方案中優(yōu)化了的Cultex RFS系統(tǒng)進(jìn)行A549細(xì)胞對(duì)清潔空氣暴露方法的，也證明Cultex RFS技術(shù)是一種很好的替代學(xué)方法，是一個(gè)重要肺毒性細(xì)胞體外模型，對(duì)吸入毒理學(xué)的發(fā)展具有重要意義。

注：細(xì)胞體外暴露方法的一個(gè)重要問(wèn)題及CULTEX的優(yōu)化方案的文中，數(shù)據(jù)和資料均引自CULTEX® LaboratorieGmbH，關(guān)于CULTEX細(xì)胞體外暴露方法及優(yōu)化方案的更多資料和數(shù)據(jù)請(qǐng)咨詢德國(guó)CULTEX® Laboratorie或中國(guó)區(qū)技術(shù)服務(wù)中心北京佰樂(lè)良成科技公司。

*終使CULTEX RFS細(xì)胞暴露模塊內(nèi)的細(xì)胞存活率保持與培養(yǎng)箱內(nèi)對(duì)照組基本相同并十分穩(wěn)定（如細(xì)胞體外暴露方法的一個(gè)重要問(wèn)題及CULTEX的優(yōu)化方案中文圖2）。