想做DAP-seq實(shí)驗(yàn)，卻滿腦子疑問(wèn)？別擔(dān)心，這篇攻略為你一次性解答所有關(guān)鍵問(wèn)題，助你輕松開(kāi)啟實(shí)驗(yàn)之旅！

一、DAP-seq是什么？能幫我解決啥問(wèn)題？

DAP-seq技術(shù)的核心原理

先在體外表達(dá)帶有特定標(biāo)簽（如His、Halo標(biāo)簽）的目的蛋白，讓其與標(biāo)簽配體結(jié)合后，再與基因組DNA共同孵育，最后洗脫結(jié)合的DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息分析。

核心優(yōu)勢(shì)

它能幫你快速鎖定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，找到其調(diào)控的下游靶基因。更給力的是，這項(xiàng)技術(shù)無(wú)需特異性抗體，無(wú)需轉(zhuǎn)基因材料，即可揭示轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作網(wǎng)絡(luò)，如今已成為植物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域解析基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵技術(shù)手段。

藍(lán)景科信DAP-seq技術(shù)流程

二、實(shí)驗(yàn)前，我需要準(zhǔn)備哪些材料？

（1）樣本材料

- 組織材料：植物組織5g、動(dòng)物組織2g、微生物2g；或提取好的基因組DNA 10μg（可根據(jù)DNA提取效率適當(dāng)調(diào)整樣本量）。

-含有轉(zhuǎn)錄因子CDS序列的質(zhì)粒：需附帶測(cè)序無(wú)誤的報(bào)告（序列準(zhǔn)確性至關(guān)重要，否則會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)周期）。

（2）組織部位如何選取？

若蛋白表達(dá)有組織或時(shí)空特異性，優(yōu)先選擇對(duì)應(yīng)時(shí)期的組織——因?yàn)槲覀兂Ｒ?guī)DAP-seq流程采用PCR-free建庫(kù)的方式，盡可能保留DNA修飾，而這些修飾可能影響蛋白與DNA的結(jié)合。

我們已完成3000+項(xiàng)目，植物的根、莖、葉、果實(shí)、種子等組織均有成功提取經(jīng)驗(yàn)。若提取失敗，可更換易提取的組織重試。此外，還可提供去除DNA修飾的ampDAP-seq流程。

（3）參考基因組用什么版本？

參考基因組建議優(yōu)先選擇您日常分析中常用的版本，如果后續(xù)需要將DAP-seq數(shù)據(jù)與其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（如RNA-seq、ATAC-seq等）進(jìn)行聯(lián)合分析，請(qǐng)務(wù)必保證所有數(shù)據(jù)使用相同版本的參考基因組，這樣才能確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性。

三、測(cè)序量和重復(fù)怎么定？

（1）測(cè)序量：

- 常規(guī)推薦：基因組的3X-5X。

- 需增加測(cè)序量的情況：

  - 物種與參考基因組匹配度低，導(dǎo)致比對(duì)率低。

  - 根部組織微生物含量高，可能降低比對(duì)率。

（2）重復(fù)設(shè)置：

我們的標(biāo)準(zhǔn)流程包含一個(gè)input對(duì)照和兩個(gè)技術(shù)重復(fù)，無(wú)需額外設(shè)置重復(fù)，可滿足文章發(fā)表需求（目前合作項(xiàng)目已發(fā)表于多個(gè)層次期刊）。

小知識(shí)：input對(duì)照是什么？

Input對(duì)照是親和純化前的文庫(kù)，即基因組DNA文庫(kù)，作用是在分析時(shí)降低背景噪音。

四、特殊情況說(shuō)明

（1）哪些樣品不能做？

- 無(wú)參考基因組的物種。

- 轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法在體外表達(dá)的情況。

除上述兩種，我們會(huì)提供可行性分析報(bào)告供參考。

（2）為什么有些基因家族成功率低？

部分轉(zhuǎn)錄因子需要和其他蛋白形成復(fù)合體才能與DNA結(jié)合，這些蛋白的實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)比較高。

五、分析結(jié)果包含哪些內(nèi)容？

藍(lán)景科信DAP-seq的生信分析包含以下內(nèi)容：

1. 原始數(shù)據(jù)處理（去接頭、污染序列及低質(zhì)量reads）

2. 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

3. 參考序列比對(duì)分析 

4. 測(cè)序reads富集區(qū)域掃描（peak calling）

5. Peak在基因功能元件上的分布統(tǒng)計(jì)

6. Peak序列模式發(fā)掘（motif search）

7. 已知motif注釋

8. Peak相關(guān)基因鑒定

9. Peak相關(guān)基因的GO和KEGG富集分析

10. 測(cè)序數(shù)據(jù)的可視化分析

六、DAP-seq、ChIP-seq、Cut&Tag怎么選？

選擇建議：

對(duì)于ChIP實(shí)驗(yàn)，需要足夠多的蛋白，為此常常將該TF過(guò)表達(dá)，然后在特定組織部位獲得該蛋白，同時(shí)需要特異性的抗體，這兩點(diǎn)關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成功與否。Cut&Tag相比ChIP-seq的優(yōu)勢(shì)是樣本投入量少，信噪比高，但是同樣需要抗體，而且對(duì)樣本的活性狀態(tài)要求很高，不兼容長(zhǎng)期凍存樣本。如果您已有轉(zhuǎn)基因材料，且有ChIP級(jí)別抗體的話，ChIP實(shí)驗(yàn)還是值得嘗試的，畢竟能夠拿到體內(nèi)結(jié)果，若難以滿足上述條件，且時(shí)間、經(jīng)費(fèi)有限，建議您優(yōu)先考慮DAP-seq實(shí)驗(yàn)。

七、結(jié)果如何驗(yàn)證？

拿到結(jié)果之后需要挑選您感興趣的靶基因，之后就要開(kāi)始驗(yàn)證環(huán)節(jié)，文獻(xiàn)中常用的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法包括：ChIP-qPCR、酵母單雜交、EMSA、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，我們可提供相關(guān)技術(shù)支持。

八、有哪些成功案例？

藍(lán)景科信已完成200+物種，3000+轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)，周期短，口碑好，助力客戶發(fā)表高分文章Cell，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，Plant Cell，PNAS，Plant Communications，Journal of Integrative Plant Biology，New Phytologist，International Journal of Biological Macromolecules，Horticulture Research，Plant Physiology等。

已做物種：