酵母質粒提取的操作方法和步驟！

酵母質粒提取的操作方法和步驟！

酵母質粒提取可以用試劑盒提取，也可以直接用裂壁酶處理后采用堿裂解法提取質粒。下面我們就用百歐博偉生物酵母質粒提取試劑盒為例講解酵母質粒提取方法和步驟。

⒈接種單菌落(待檢測酵母細胞)于25mLYNB(補加氨基酸 營養物)培養基中，30℃振蕩培養隔夜。

⒉第二天取一滴菌液于進行顯微鏡下觀察,目鏡用16,物鏡用40倍觀察細胞壁破碎前的狀態,其成桿狀,流動性比較下.

⒊取10ml的培養酵母菌液,5000g離心3min,棄上清液.加入5ml的1倍TE懸浮.

⒋將懸浮液倒入高壓破壁儀的樣品管中,利用高壓破碎機進行破碎細胞壁,壓力加到20Mpa,停留15s,降壓,反復來回壓3次.取出細胞液,取一滴于顯微鏡下觀察,如果細胞呈不規則的球狀時,而且其流動性 比較大,說明其細胞壁已經破碎成為原生質體.

⒌取2個EP管,每管加入1.5ml上述的細胞液,12000g離心5min,收集原生質體.棄取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混勻冰浴5min,進行破原生質體.

⒍然后加入150ul的tris飽和酚,和150ul的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1),混勻,12000g,離心10min.

⒎將水相移到另一EP管中,加入等體積的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1), 混勻,12000g,離心10min.

⒏將水相移到另一EP管中,加入1/10體積的3M KAC溶液和2倍體積的無水乙醇,放入-20℃冰箱中

⒐1h,12000g離心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的無水乙醇,混勻,12000g,離心10min.

⒑棄去乙醇,等室溫干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去處RNA酶,加入1ul的100mg/ml濃度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可.

⒒跑電泳進行檢測是否從酵母菌中提出質粒了。

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