革蘭氏染色的實驗原理與方法步驟！

革蘭氏染色的實驗原理與方法步驟！

革蘭氏染色（Gram Staining）是用來鑒別細菌的一種方法：這種染色法利用細菌細胞壁上的生物化學性質不同，可將細菌分成兩類，即革蘭氏陽性（Gram Positive）與革蘭氏陰性（Gram Negative）。這一染色方法由丹麥醫生漢斯·克里斯蒂安·革蘭于1884年所發明，初是用來鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關系，后推廣為鑒別細菌種類的重要特性之一，對由細菌感染引起的疾病的臨床診斷及治療有著廣泛用途。

⒈步驟

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸銨結晶紫染1分鐘。

3）蒸餾水沖洗。

4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。

5）水洗，用吸水紙吸去水分。

6）加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。

7）蕃紅染色液（稀）染1分鐘后，蒸餾水沖洗。干燥，鏡檢。

⒉原理

通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

染色的差異主要是陰性與陽性細菌細胞壁的差異所引起的。

①革蘭氏陽性細菌的細胞壁

G+細菌細胞壁具有較厚（20-80nm）而致密的肽聚糖層，多達50層，占細胞壁成分的40%～95%，它同細胞膜的外層緊密相連（圖2-9）。有的G+細菌細胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負電荷，它在細胞表面能調節陽離子濃度。磷壁酸與細胞生長有關，細胞生長中有自溶素（autolysins）酶類起作用，磷壁酸對自溶素有調節功能，阻止胞壁過度降解和壁溶。

如果細胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細胞成為原生質體（protoplasts），細胞壁不復存在，而只存留細胞膜。除鏈球菌外，大多數G+細菌細胞壁中含極少蛋白質。

②革蘭氏陰性細菌的細胞壁 G—細菌細胞壁比G+細菌細胞壁薄（15～20nm）而結構較復雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）（圖2-10）。在細胞壁和細胞質膜之間有一個明顯的空間，稱為壁膜間隙（periplasmic space）。

外膜 G—細菌細胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細胞質膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質。

LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復分支的碳水化合物分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由于糖的種類不同，使各種G—細胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。

外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調控外界分子進入細胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G—細菌對高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內毒素（endotoxins）。

肽聚糖層 G—細菌細胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細菌中僅有單層。肽聚糖層和外膜的內層之間通過脂蛋白連接起來。

壁膜間隙 G—細菌細胞壁的外膜與細胞質膜之間存在明顯的壁膜間隙，一層薄的肽聚糖處于其間，肽聚糖層和細胞質膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠胨態。其間含有三類蛋白質：水解酶，催化食物的初步降解；結合蛋白，啟動物質轉運過程；化學受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。

⒊染色結果

革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

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