【儀表網 研發快訊】面向原位結構解析的冷凍電子斷層成像(cryo-ET)是研究生物大分子復合物的原位高分辨率結構及其相互作用關系的關鍵技術。但受限于電子束穿透能力，需要先利用聚焦離子束(cryo-FIB)將細胞和組織樣品減薄成200納米左右的薄片后才能進行cryo-ET數據采集。冷凍光電關聯成像技術可以為cryo-FIB精準制備包含特定目標結構的冷凍含水切片提供熒光定位指導，但是冷凍熒光顯微鏡的光學分辨能力以及光鏡、電鏡圖像的對齊精度是制約冷凍光電關聯實驗成功率的關鍵因素。
 

　　為了解決上述技術瓶頸，中國科學院生物物理研究所蛋白質科學研究平臺生物成像中心一直致力于開發新型冷凍光電關聯成像技術，在前期自主研發的冷凍光電關聯成像高真空光學冷臺HOPE(Journal of Structural Biology，2017)基礎上，通過引入結構光照明成像技術，成功研制了冷凍結構光照明成像系統HOPE-SIM，實現了橫向優于200納米的光學分辨率，以及優于150納米的光鏡-聚焦離子束三維關聯對齊精度，相關研究成果于4月29日在線發表在《通訊-生物》(Communications Biology)上。
 

　　光鏡-電鏡關聯成像技術(Correlative Light and Electron Microscopy，CLEM)，是利用熒光特異標記對特定生物大分子或亞細胞結構進行熒光示蹤，實現對整個細胞的三維熒光定位成像，之后通過熒光圖像和電鏡圖像的配準，獲得熒光標記信號和電鏡超微結構的關聯信息。冷凍光電關聯成像技術的應用方向之一，是通過關聯圖像，指示出熒光標記的結構在電鏡圖像中的具體位置，實現對熒光示蹤目標物的電鏡高分辨率結構解析。而得益于光鏡成像對生物樣品的無損特性，可以在不損傷樣品的前提下獲得樣品內部的三維熒光定位信息，再通過光電關聯成像流程和關聯對齊軟件，將三維熒光圖像與掃描電鏡圖像關聯匹配，實現在熒光信號的指導下進行cryo-FIB對目標區域的減薄加工。如此，便可以避免“盲切”，實現對熒光指示目標物的指導切割，以期提高冷凍聚焦離子束技術用于電子斷層成像切片樣品制備的效率。
 

　　目前，光電關聯成像指導cryo-FIB減薄技術流程的實現方式有多種類型，根據系統構成可以分為光鏡電鏡分體式光電關聯成像系統和集成型光電關聯成像系統。生物成像中心技術團隊自2013年開始專注于冷凍光電關聯成像技術方法學研究，在光鏡電鏡分體式光電關聯成像系統研制方面， 于2017年自主研制了一款可搭載在倒置熒光顯微鏡上的高真空光學冷臺HOPE(High-vacuum Optical Platform for cryo-CLEM)，HOPE可與透射電鏡冷凍樣品桿適配連接，完成熒光定位后樣品將隨冷凍樣品桿被轉移進電鏡當中進行高分辨率數據采集，同時結合光電關聯定位軟件，可以實現大視野光學定位成像與電鏡成像的匹配。HOPE采用冷凍樣品桿來實現冷凍光鏡成像、冷凍傳輸以及冷凍透射電鏡成像，有效避免了光電關聯成像過程中對冷凍載網的反復夾取，保證了冷凍樣品的完整性和同一性，有效提高了關聯成功率和實驗效率。
 

　　然而，基于寬場成像技術的HOPE系統受限于光學衍射極限和冷凍光學成像裝置的空間限制等，僅能使用長工作距離、低數值孔徑的冷凍熒光成像系統，所能達到的橫向分辨率約為400-500納米，縱向分辨率則達微米級，這對于精準捕獲數微米厚度細胞內百納米尺度的目標結構而言，是非常不利的。
 

　　結構光照明超分辨熒光成像技術在能提高寬場熒光顯微鏡一倍分辨率的前提下，還具備不需要特殊的熒光探針、成像速度快、輻照密度低等技術優勢，是所有超分辨成像技術中最適合應用到冷凍環境中對冷凍樣品進行高分辨率成像的技術。因此，研究團隊選擇了結構光照明成像技術作為提高冷凍熒光成像分辨率的手段，基于倒置熒光顯微鏡自主研制了大腔室高真空冷臺，腔室內置0.9NA長工作距離光學物鏡和防污染器系統(ACS和cryo-box)、外接真空傳輸系統(TPS)以及冷凍電鏡樣品桿(cryo-holder)適配器。同時，借助三維結構光照明(SIM)光路，實現了真空環境下對冷凍樣品的三維結構光照明成像，在提高冷凍光鏡分辨率的同時，有效增強了光電關聯成像樣品傳輸過程中對冷凍樣品的保護。
 

　　圖1 冷凍結構光照明成像系統HOPE-SIM。a.HOPE-SIM硬件組成，b. HOPE-SIM設計原理圖，c. HOPE-SIM光路原理圖
 

　　借助HOPE-SIM高分辨率冷凍光電關聯成像系統以及自主編寫的三維關聯對齊軟件3D-View，團隊成功制備了包含宿主細胞內鼠皰疹病毒(圖2)和海拉細胞內熒光標記的中心體(圖3)的細胞切片樣品，通過冷凍電子斷層原位結構分析圖像處理流程和軟件分析其在原位結構。實驗結果表明，基于HOPE-SIM技術的高精度冷凍光電方法可以實現優于150nm的三維對齊精度，為尺寸較大、胞內豐度高的目標物的原位捕獲提供了一種高效、精確的靶向冷凍聚焦離子束減薄技術方案。
 

　　圖2 基于 HOPE-SIM冷凍光電聯技術捕獲宿主細胞中的MHV-68病毒顆粒。a.冷凍明場透射光圖像；b.HOPE-SIM熒光圖像的z投影。綠色，熒光微球。紅色，MHV-68病毒；c將b中的熒光圖像與a中的明場圖像合并，以顯示目標信號的位置；d.冷凍SIM和冷凍FIB圖像之間的三維關聯匹配；e.對目標區域減薄后的冷凍FIB圖像；f.減薄后冷凍掃描電鏡圖像，與b中冷凍SIM圖像的融合；g.制備的冷凍含水切片的冷凍透射電鏡顯微照片(3600倍)；h.冷凍斷層掃描成像，放大倍率為64000倍，顯示了被捕獲的病毒顆粒。
 

　　圖3 基于HOPE-SIM技術流程精準捕獲海拉細胞內紅色熒光標記的中心體。a.3D-View光-電關聯軟件獲得的冷凍結構光-cryo-FIB關聯配準圖；b.cryo-FIB對紅色熒光標記所在區域進行減薄；c.cryo-FIB減薄獲得的200nm冷凍含水切片；d.冷凍含水切片在透射電鏡下8700倍成像，黃色框線內為目標中心體；e.目標中心體的cryo-ET數據采集(53000倍)激光指向位置主動穩定系統示意圖。
 

　　相關研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中科院戰略性先導科技專項(B類)等項目的資助。
 

　　值得一提的是，在集成型光電關聯成像系統研制方面， 2023年1月，《自然-方法》(Nature Methods)報道了中科院院士、生物物理所研究員徐濤和研究員紀偉團隊研發的cryo-CLIEM系統和生物成像中心技術團隊自主研發的三束共焦成像系統ELI-TriScope系統，在雙束掃描電鏡真空腔室內集成了光學成像系統，避免了樣品傳輸過程，有效提高了冷凍光電關聯成像的精度和成功率。其中生物成像中心技術團隊自主研發ELI-TriScope系統集成了一個基于冷凍樣品桿的傳輸系統(cryo-transfer system)，并在冷凍樣品下方嵌入了一個倒置熒光成像系統(cryo-STAR system)，從而實現電子束(E)、光束(L)和離子束(I)被精確地聚焦到同一點上，可以在cryo-FIB減薄的同時實時監控目標分子的熒光信號，顯著提高了cryo-FIB減薄技術對特定目標物的捕獲精度，將制備冷凍含水切片的時間成本從每片2-2.5小時降低到約0.8小時。
 

　　生物成像中心技術團隊研發的基于結構光照明技術的HOPE-SIM系統可以實現三維高分辨率冷凍熒光成像，同時還可以通過冷凍樣品桿直接銜接三束共焦光電關聯成像系統ELI-TriScope，實現高分辨三維冷凍熒光成像的同時，完成后續原位熒光實時監控聚焦離子束減薄全技術流程，有效提高了冷凍聚焦離子束減薄的效率、準確性、成功率和樣品制備通量，為原位結構解析研究提供了成功的解決方案，在未來的原位結構生物學中有巨大應用潛力。