【儀表網 研發快訊】中國科學院上海微系統與信息技術研究所傳感技術國家重點實驗室李昕欣/徐鐵剛團隊在高精度數字PCR系統研制方面取得重要進展，研制出依賴液相高壓環境使用PDMS薄膜芯片實現高性能數字PCR系統。相關成果以“Overcoming bubble formation in polydimethylsiloxane-made PCR chips: mechanism and elimination with high-pressure liquid seal”為題發表在學術期刊《Microsystems & Nanoengineering》上(https://www.nature.com/articles/s41378-024-00725-1)。
 

　　該文章被雜志社評選為Featured文章，并在國際學術宣傳平臺“Newswise”以“New PCR chip design: high-pressure liquid seal solves bubble problem”為題進行了高度評價。新聞評論說：“這一突破的意義遠遠超出了實驗室的范疇，這項創新能推動具有成本效益的一次性 PCR 芯片的開發，在臨床醫療領域可依靠有限資源獲得最先進的診斷結果。技術簡單高效，有望加速微流控 PCR 技術與臨床實踐和研究的結合，推進精準醫療的發展。”(https://www.newswise.com/articles/new-pcr-chip-design-high-pressure-liquid-seal-solves-bubble-problem)。
 

　　數字PCR是近年來迅速崛起的單分子水平的精準基因定量分析技術。數字PCR通過微流控芯片技術同步進行數萬個等體積的、獨立的PCR反應，然后統計陽性反應比例，根據泊松分布原理計算被測樣品中目標分子的絕對數量。該技術判定不需要標準曲線，比目前廣泛應用的定量PCR產品更加精準可靠，是定量PCR技術理想的迭代更新產品?，F有的商業化數字PCR系統容易出現由氣泡造成的體積誤差，而且需要密封殼和微閥等復雜結構來防止PCR溶液蒸發及氣泡擴大，導致反應速度慢、成本高、操作復雜，致使應用仍主要局限于科研領域。
 

　　研究團隊闡明了PDMS芯片在PCR過程中產生氣泡的機制，發現高溫時水的飽和蒸氣壓過高才是引起芯片在PCR反應過程中產生氣泡的主要原因，會導致氣泡體積劇增6.4倍，遠遠超過早期研究者曾經關注的0.2倍體積的熱膨脹。氣泡擴增會把PCR溶液擠出反應單元，不但毀掉自身反應單元還會給其它反應單元造成交叉污染。PDMS芯片在熱循環時伴隨著水的氣化-液化循環，導致高溫時水蒸氣從反應溶液體系中不斷釋放到芯片PDMS材料的納米孔體系中，進一步蒸發到外部空氣中。低溫時芯片外部的冷空氣通過納米孔介導被不斷吸入到芯片材料內，并進入反應腔室。二者共同作用形成水蒸氣增強的“呼吸”現象，加速了PCR溶液的蒸發，導致PCR失敗。
 

　　水蒸氣對 PCR 過程中氣泡形成的影響(溫度：25-95 °C，壓力：101.325 kPa)。(a)水的飽和蒸汽壓曲線。(b)熱膨脹僅導致氣體體積略有增加(黑線)，而水蒸氣的平衡效應導致等溫膨脹體積大幅度增大(紅線)。(c)PCR 過程中脫氣PDMS 產生的氣泡體積計算值。(d)從水中溶解的空氣溢出后形成的飽和水蒸氣體積。(e)氣泡形成的可能機制，涉及熱膨脹 、PDMS 和 PCR 溶液中空氣的溢出和水蒸氣平衡。

 

　　團隊應用此理論開發出基于液相高壓反應平臺的無閥非密封PDMS薄膜數字PCR系統：高溫時，PDMS芯片納米孔內部氣體受熱后壓強升高，但是無法突破外部水環境的高壓；低溫時，水環境阻止了外部氣體倒吸入PDMS芯片，杜絕氣泡的形成。該系統中，儀器實現高壓液相環境以阻止氣泡產生和PCR溶液水損失；一次性PDMS芯片實現PCR芯片的樣品填充和數字化分離。由于不需要密封殼，簡化了PDMS芯片制造工藝，使芯片成本大幅下降；由于即不需要開關閥門也不需要密封芯片的樣品進出口，簡化了芯片操作，在保持高準確度的前提下提高了檢測速度，實現高效PCR擴增。與市場上現有的數字PCR系統相比，該系統優勢顯著，具備良好的產業化前景，有望應用于安全防護、疾控中心、重癥監護室、門急診、海關、生物制藥等多個領域。
 

　　左上：結構簡單的裸露PDMS芯片及其數字化結果；左下：常壓氣相環境下芯片由于氣泡以及蒸發導致反應失??；右邊：高壓液相反應示意以及PCR反應結果。