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PCR基因擴增技術特點匯集

時間:2025/7/8閱讀:66
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基因擴增技術(PCR)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction簡稱PCR)又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法,是基因擴增技術的一次重大革新。

PCR的特點

  一、特異性高
  報導的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段,其酶活性在90℃會變性失活,需每次PCR循環都要重新加入Klenow大片段,同時引物是在37℃延伸(聚合)易產生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差,1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩定的Taq DNA聚合酶,在熱變性處理時不被滅活,不必在每次循環擴增中再加入新酶,可以在較高溫度下連續反應,顯著地提高PCR產物的特異性,序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中,單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一,足可以提供特異性分析,選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細胞可以發現部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
 
  二、高度敏感
  理論上PCR可以按2n倍數擴增DNA十億倍以上,實際應用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞,或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。
 
  三、快速及無放射性
  一般在2小時內約可完成30次以上的循環擴增,加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成,不用分離提純病毒,DNA粗制品及總RNA均可作為反應起始物,可直接用臨床標本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發、細胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴增檢測,省去費時繁雜的提純程序,擴增產物用一般電泳分析即可,不一定用同位素,無放射性易于推廣。
 
  四、簡便
  擴增產物可直接供作序列分析和分子克隆,擺脫繁瑣的基因方法,可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因,省去常規方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構建一個內切酶位點,擴增的靶DNA可直接克隆到M13,PUC19等相應酶切位點的載體中。
 
  五、可擴增RNA或cDNA
  先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉錄酶將mRNA轉變成單鏈cDNA,再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增,即使mRNA轉錄片段只有100ngcDNA中的0.01%,也能經PCR擴增1ng有242堿基對長度的特異片段,有些外顯子分散在一段很長的DNA中,難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板,則可將外顯子集中,用PCR一次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析。
 


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