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貨號	FS-X9640

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒

英文名稱：CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit

產(chǎn)品規(guī)格：500T

貨號：FS-X9640

產(chǎn)品介紹:

CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit 是基于CFDA, SE對細(xì)胞進(jìn)行示蹤及增殖檢測的試劑盒，由CFDA,SE粉末、溶劑及相關(guān)細(xì)胞染色緩沖液組成，該試劑盒主要工作原理為：CFDA, SE具有細(xì)胞膜滲透性，本身不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過被動運輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后，可被胞漿內(nèi)的酯酶催化生成羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE），后者可發(fā)強烈的綠色熒光，不能穿透細(xì)胞膜，能完好的保留在胞內(nèi)。CFSE還可自發(fā)性并不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合從而偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，同時過量且未被偶聯(lián)的CFDA, SE通過被動擴散回到細(xì)胞外培養(yǎng)基內(nèi)，被后續(xù)清洗步驟所清除。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時間可達(dá)數(shù)月，因此非常適用于細(xì)胞群落分析。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，優(yōu)于以前使用的其他細(xì)胞示蹤熒光探針如PKH26，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過程中，CFSE 標(biāo)記熒光可平均分配至兩個子代細(xì)胞中，熒光強度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過流式細(xì)胞儀（FL1通道）根據(jù)熒光強度的不同，可檢測出未分裂細(xì)胞，分裂一次（1/2的熒光強度），二次（1/4的熒光強度），三次（1/8的熒光強度），以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞。CFSA，SE可檢測分裂次數(shù)多達(dá)八次甚至更多。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會使鄰近細(xì)胞染色的功能。CFDA, SE常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測，也可用于成纖維細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，造血祖細(xì)胞等其他細(xì)胞的增殖檢測。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，Ex=494nm，Em=521nm，除了流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖外，還可用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。

本品為CFDA，SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒，包含配制CFDA，SE儲存液所需的溶劑和細(xì)胞標(biāo)記用的染色緩沖液，簡化了實驗前期準(zhǔn)備工作。另，CFDA,SE標(biāo)記細(xì)胞一般15min即可完成，對于不同細(xì)胞，需要自行摸索佳標(biāo)記時間。按照每個樣本的標(biāo)記體積為2ml計算。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

β細(xì)胞su(βTC)檢測試劑盒 forBetacellulin(bTC)

R-脊椎蛋白3(RSPO3)檢測試劑盒 forR-Spondin3(RSPO3)

羰基還原mei1(CBR1)檢測試劑盒 forCarbonylReductase1(CBR1)

維生suD結(jié)合蛋白(DBP)檢測試劑盒 forVitaminDBindingProtein(DBP)

谷丙轉(zhuǎn)氨mei(ALT)檢測試劑盒 forAlanineAminotransferase(ALT)

早期B-細(xì)胞因子1(EBF1)檢測試劑盒 forEarlyB-CellFactor1(EBF1)

骨成型蛋白3(BMP3)檢測試劑盒 forBoneMorphogeneticProtein3(BMP3)

細(xì)胞周期suM4(CCNM4)檢測試劑盒 forCyclinM4(CNNM4)

冠蛋白1C(CORO1C)檢測試劑盒 forCoronin1C(CORO1C)

發(fā)動蛋白2(DNM2)檢測試劑盒 forDynamin2(DNM2)

7-脫氫還原mei(DHCR7)檢測試劑盒 for7-DehydrocholesterolReductase(DHCR7)

Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)檢測試劑盒 forBcl2AssociatedXProtein(Bax)

轉(zhuǎn)錄激活因子7(ATF7)檢測試劑盒 forActivatingTranscriptionFactor7(ATF7)

防御suα5(DEFα5)檢測試劑盒 forDefensinAlpha5,PanethCellSpecific(DEFa5)

多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移mei7(GALNT7)檢測試劑盒 forPolypeptide-N-Acetylgalactosaminyltransferase7(GALNT7)

胞裂蛋白6(SEPT6)檢測試劑盒 forSeptin6(SEPT6)

皮質(zhì)su1(CTXN1)檢測試劑盒 forCortexin1(CTXN1)
細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒lv胍相關(guān)物質(zhì)D標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：Proguanil Related Compound D

西平相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：

醋suanfu輕松標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Fluocinonide

西丁標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Cefoxitin

雙羥萘suan撲蟯寧標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Pyrvinium Pamoate

紅霉su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Erythromycin Estolate

諾孕酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Norgestimate

馬來suan卡比沙明標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Carbinoxamine Maleate

甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:300mg 英文名稱：Mannose

鹽suan哌丁an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Loperamide Hydrochloride
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)