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貨號(hào)	FS-X9625

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 488)

英文名稱：TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)

產(chǎn)品規(guī)格：20T

貨號(hào)：FS-X9625

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Alexa Fluor 488）可以用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡晚期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-羥基（3′-OH）末端摻入Alexa Fluor 488-12-dUTP，從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

Alexa Fluor 488染料穩(wěn)定性更高，信號(hào)更強(qiáng)，從而使標(biāo)記物更亮，抗淬滅能力更強(qiáng)。

試劑盒組份：

5×Equilibration Buffer ——————————750μl

Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix————100 μl

Recombinant TdT Enzyme ——————————20 μl

Proteinase K(2 mg/ml)——————————— 40 μl

DNase I (1 U/μl)————————————— 5μl

10×DNase I Buffer with MgCl2—————— 100 μl

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期一年。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

α淀粉mei(AMS/AMY)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：AMS/AMY ELISA Kit，AMS/AMY，

Tau蛋白(TAU)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TAU ELISA Kit，TAU，

PL7抗體/抗蘇氨酰tRNA合成mei(PL7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PL7 ELISA Kit，PL7，

人抗環(huán)胍氨suan肽抗體(CCP)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CCP ELISA Kit，CCP，

解整合su樣金屬蛋白mei9(ADAM9)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ADAM9 ELISA Kit，ADAM9，

人抗Ku抗體(anti-Ku-Ab)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：anti-Ku-Ab ELISA Kit，anti-Ku-Ab，

間-alpha-胰蛋白mei抑制劑重鏈H4(ITIH4/IHRP/ITIHL1/PK120/PRO1851)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ITIH4/IHRP/ITIHL1/PK120/PRO1851 ELISA Kit，ITIH4/IHRP/ITIHL1/PK120/PRO1851，

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1a(SDF1A)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：SDF1A ELISA Kit，SDF1A，

肌腱蛋白R(TN-R)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TN-R ELISA Kit，TN-R，

黑色su瘤活性抑制蛋白(MIA)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MIA ELISA Kit，MIA，

胱天蛋白mei3(Caspase-3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Caspase-3 ELISA Kit，Caspase-3，

谷氨suan脫氫mei(GDH/GLDH)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：GDH/GLDH ELISA Kit，GDH/GLDH，

肝臟甘油三脂脂肪mei(HTGL)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：HTGL ELISA Kit，HTGL，

富亮氨suanα2糖蛋白1(LRG1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：LRG1 ELISA Kit，LRG1，

神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(NAIP)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：NAIP ELISA Kit，NAIP，

熱休克蛋白60(Hsp-60)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Hsp-60 ELISA Kit，Hsp-60，

殺jun性/通透性增加蛋白(BPI)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：BPI ELISA Kit，BPI，
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 488)標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Phenylbutazone

左沙丁anchun鹽suan鹽標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Levalbuterol Hydrochloride

雌二chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Estradiol

雌三chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Estriol

龍標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Prednisolone

乳suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1.5ml×3ampules 英文名稱：Lactic Acid

骨化chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:30mg×5ampules 英文名稱：Ergocalciferol (Vitamin D2)

相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：

醉椒su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Kawain

癸fu標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)