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貨號(hào)	FS-X9537

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光)

英文名稱：One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20次|50次

貨號(hào)：FS-X9537

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒提供了一種高靈敏度又快速簡(jiǎn)便的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。對(duì)于經(jīng)過固定和洗滌的細(xì)胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應(yīng)，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)到呈現(xiàn)紅色熒光的凋亡細(xì)胞。本試劑盒足夠檢測(cè)20個(gè)樣品。

試劑盒組分：

TdT酶—————————40μl

熒光標(biāo)記液——————960μl

TdT酶稀釋液(選用)———00μl

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl

Transferase,TdT)的催化下加上紅色熒光探針Cy3(Cyanine 3)標(biāo)記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。

TUNEL法特異性檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂，但不會(huì)檢測(cè)出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開，另一方面也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞。

極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒有DNA斷裂，此時(shí)不適用TUNEL法檢測(cè)。在個(gè)別類型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測(cè)呈陽性。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下，好同時(shí)檢測(cè)多個(gè)凋亡指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

眼皮膚白化病Ⅱ蛋白(OCA2)檢測(cè)試劑盒 forOculocutaneousAlbinismII(OCA2)

mei-3(PON3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PON3 ELISA Kit，PON3，

轉(zhuǎn)運(yùn)體樣蛋白4(SLC44A4)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：SLC44A4 ELISA Kit，SLC44A4，

低分子質(zhì)量蛋白7/β型蛋白mei體9(LMP7/PSMB9)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：LMP7/PSMB9 ELISA Kit，LMP7/PSMB9，

促jia狀腺su受體抗體(TRAb)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TRAb ELISA Kit，TRAb，

腸三葉因子(ITF)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ITF ELISA Kit，ITF，

suan激meiR型同工mei(R-PK)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：R-PK ELISA Kit，R-PK，

白血病抑制因子受體(LIFR)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：LIFR ELISA Kit，LIFR，

白介su24(IL-24)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：IL-24 ELISA Kit，IL-24，

癌胚抗原(CEA/CD66)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CEA/CD66 ELISA Kit，CEA/CD66，

β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：β-actin ELISA Kit，β-actin，

α黑色su細(xì)胞刺激su(α-MSH)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：α-MSH ELISA Kit，α-MSH，

人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：pANCA ELISA Kit，pANCA，

人抗角蛋白抗體(AKA)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：AKA ELISA Kit，AKA，

人抗腎小管基底膜抗體(TBM)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TBM ELISA Kit，TBM，

人抗白蛋白抗體(AAA)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：AAA ELISA Kit，AAA，

精氨suan(Arg)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Arg ELISA Kit，Arg，
一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光)聚乙烯乙suan酯分散體標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Polyvinyl Acetate Dispersion

均聚物聚丙烯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:3 strips 英文名稱：Homopolymer Polypropylene

辛ben聚糖標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200ml 英文名稱：Octoxynol 9

聚乙烯chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Polyvinyl Alcohol

高密度聚乙烯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:3 strips 英文名稱：High Density Polyethylene

低密度聚乙烯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:3 strips 英文名稱：Low-Density Polyethylene

狹葉紫錐菊提取物標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：

絨毛膜促性激su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1 vial 英文名稱：Human Chorionic Gonadotropin

促腎上腺皮質(zhì)激su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:5 vails 英文名稱：Corticotropin

木瓜mei標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Papain
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)