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貨號 | FS-X9549 |
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產品屬性:
產品名稱 | 英文名稱 | 產品規格 | 產品貨號 |
Adenovirus expressing GFP-LC3B fusion protein | 1ml|10×1ml | FS-X9549 |
產品介紹:
本品是一種可以表達GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒,可以用于感染細胞或組織后進行細胞自噬(autophagy)的檢測。 LC3是酵母自噬關鍵蛋白ATG8在哺乳動物中的同源蛋白。LC3初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3 。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族,其中對于LC3B的研究為廣泛。到目前為止,LC3B被認為是細胞自噬信號通路為關鍵的標志性蛋白。LC3B是一個具有125個氨基酸殘基的蛋白,在蛋白合成后,被Atg4所酶切而失去了C端的22個氨基酸蛋白,從而暴露出C端的甘氨suan,人們把它命名為胞質形式的LC3B I。在細胞自噬的過程中,其C端暴露的甘氨suan經過一個類似泛素化的過程,以ATG7為E1樣激活酶, 以ATG3為E2樣連接酶,以Atg12-Atg5-Atg16復合物為E3樣連接酶,在C端甘氨suan上共價連接上磷脂酰而成為LC3B-PE即LC3B II。與胞質定位的LC3B I不同,LC3B II定位于自噬體的內膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后,自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切,而自噬體內膜上的LC3B II則被溶酶體內的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大,但由于其強的疏水性,在SDS-PAGE電泳時,LC3B II比LC3B I遷移得更快,其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細胞后,在非自噬的情況下,熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細胞質中;而在自噬的情況下,熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上,以斑點的形式表現出來。 自噬是一種在進化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細胞內分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關,在饑餓等不利的環境條件下, 細胞通過自噬降解多余或異常的細胞內組分,為細胞的生存提供能量及原材料,促進生物體的生長發育、細胞分化及對環境變化產生應答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關系。由于細胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用,自噬已經成為細胞生物學領域的一個新的研究熱點。 Ad-GFP-LC3B是的重組腺病毒,感染后能夠在靶細胞中有效表達綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白,呈現明亮的綠色熒光,可以用于細胞自噬的檢測。 腺病毒感染細胞后為瞬時表達,通常不會與基因組DNA重組,不能用于篩選穩定細胞株。本產品感染體內外細胞后,有效表達時間通常不少于7天,不同細胞和組織的有效表達時間有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表達很可能會大大減弱。 Ad-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重組腺病毒載體系統,感染普通的細胞后不能進行擴增和重組,從而可以有效降低本產品在活體生物中的風險。 本產品可以在表達E1的HEK293A、HEK293等適當細胞中擴增。 本產品的滴度≥1×108 pfu/ml,使用時可以按照108pfu/ml進行計算。如果按照20 MOI感染6孔板的細胞,每孔50萬細胞計算,共可以感染10個孔;如果按照20 MOI感染24孔板的細胞,每孔10萬細胞計算,共可以感染50個孔。如果MOI值提高,則相應可以感染的孔數會減少;如果MOI值降低,則相應可以感染的孔數會增加。 儲存條件:-20℃,有效期1~2個月。 |
注意事項:
1、本試劑盒僅供科學研究使用,不可用于診斷或治療。
2、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋和管內壁上的液體離心至管底,避免開蓋時試劑損失。
3、禁止與其他品牌的試劑混用,否則會影響使用效果。
4、樣品或試劑被細菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導致錯誤的結果。
5、最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿,可重復使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并*清除殘留清潔劑。
6、避免皮膚或粘膜與試劑接觸。
7、需長時間保存可-20℃避光保存。避免反復凍融,否則將會增加空白吸收,從而影響檢測結果。最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光。
8、用培養基或 PBS 來配制待檢測藥物。如果待測藥物有還原性,則測定不含細胞,僅含有 MTS 的待測藥物溶液在 490 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小,則可以直接加入 MTS ,如果吸光度相對較大,則需要除去培養基,并用新鮮培養基洗滌細胞兩次,然后加入新的 100 μl 培養基和 10 μl MTS 進行檢測。
9、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。
10、加 MTS 溶液后孵育時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定,對于大多數情況孵育 1 小時即可,白細胞需要培養較長時間。
11、如果不是使用 96 孔板檢測,MTS 溶液的用量相應等比例增加即可。
主要性蛋白(MBP)檢測試劑盒 forMajorBasicProtein(MBP)
皮膚橋蛋白(DPT)檢測試劑盒 forDermatopontin(DPT)
絲氨suan蛋白mei抑制蛋白E3(SERPINE3)檢測試劑盒 forSerpinE3(SERPINE3)
基質金屬蛋白mei3(MMP3)檢測試劑盒 forMatrixMetalloproteinase3(MMP3)
封閉蛋白3(CLDN3)檢測試劑盒 forClaudin3(CLDN3)
組蛋白乙酰基轉移mei1(HAT1)檢測試劑盒 forHistoneAcetyltransferase1(HAT1)
神經正五聚蛋白受體(NPTXR)檢測試劑盒 forNeuronalPentraxinReceptor(NPTXR)
細胞胱硫醚γ裂解mei(CSE)檢測試劑盒 forCystathionineGammaLyase(CSE)
抗生長激su抗體(Anti-GHAb)檢測試劑盒 forAnti-GrowthHormoneAntibody(Anti-GHAb)
正五聚蛋白3(PTX3)檢測試劑盒 forPentraxin3,Long(PTX3)
NeurabinⅠ蛋白(NRB1)檢測試劑盒 forNeurabinI(NRB1)
巖藻糖激mei(FUK)檢測試劑盒 forFucokinase(FUK)
防御suα1(DEFα1)檢測試劑盒 forDefensinAlpha1,Neutrophil(DEFa1)
朊病毒蛋白(PRNP)檢測試劑盒 forPrionProtein(PRNP)
S100鈣結合蛋白A6(S100A6)檢測試劑盒 forS100CalciumBindingProteinA6(S100A6)
抑瘤suM受體(OSMR)檢測試劑盒 forOncostatinMReceptor(OSMR)
輔肌動蛋白α2(ACTN2)檢測試劑盒 forActininAlpha2(ACTN2)
Ad-GFP-LC3B去氫膽suan標準品 規格:200mg 英文名稱:Dehydrocholic Acid
普伐他汀相關物質B標準品 規格:20mg 英文名稱:
伐他汀鈉標準品 規格:50mg 英文名稱:Pravastatin Sodium
D-泛chun標準品 規格:500mg 英文名稱:Dexpanthenol
克拉霉su有關物質A標準品 規格:50mg 英文名稱:
克拉霉su標準品 規格:100mg 英文名稱:Clarithromycin
克拉霉su鑒別用標準品 規格:20mg 英文名稱:Clarithromycin Identity
沙必利標準品 規格:200mg 英文名稱:Cisapride
普伐他汀相關物質A標準品 規格:15mg 英文名稱:
乳糖chun標準品 規格:500mg 英文名稱:Lactitol
操作步驟:
1、貼壁細胞的消化
①吸除培養液,用無菌 PBS、Hanks 液或無血清培養液洗滌細胞一次,以去除殘余的血清。
②加入少量Trypsin-EDTA solution,略蓋過細胞即可,室溫放置 0.5~2min, 不同的細胞消化時間有所不同。
③顯微鏡下觀察,細胞明顯收縮,并且肉眼觀察培養器皿底部發現細胞的形態發生明顯的變
化;或者用槍吹打細胞發現細胞剛好可以被吹打下來,吸除細胞消化液。加入含血清的*細胞培養液,吹打下細胞,即可直接用于后續實驗。
④如果發現消化不足,則加入 Trypsin-EDTA solution 重新消化。
⑤如果發現細胞消化時間過長,未及吹打細胞,細胞已經有部分直接從培養器皿底部脫落, 直接用細胞培養液把細胞全部吹打下來。1000~2000g 離心 1min,沉淀細胞,盡量去除細胞消化液后,加入含血清的*培養液重新懸浮細胞,即可用于后續實驗。
2、組織的消化不同的組織需要消化的時間相差很大,通常以消化后可以充分打散組織為宜。
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